Etest för MIC-bestämning

Etest for MIC-determination

1. Grundmedium
2. Beredning av medium och agarplattor
3. Beredning av inokulat
4. Hantering av Etest
5. Inkubering
6. Avläsning av resultat
7. Kommentarer

Etest^® är en kommersiellt tillgänglig produkt för bestämning av bakteriers känslighet för antibiotika (AB Biodisk, Solna, Sweden). Det antibiotikum som skall testas finns applicerat på ena sidan av en plastremsa i en predefinierad koncentrationsgradient, vanligen 0,016-256 mg/L. Remsan placeras på en agarplatta med insådd av bakterier, och efter inkubering avläses resultatet som den minsta hämmande koncentrationen (MIC) av ett antibiotikum, uttryckt i mg/L. Metoden har jämförts med agarspädningsmetod (referensmetod) för de flesta bakteriearter och har visats ge god överensstämmelse.

Etest^® kan användas för MIC-bestämning av enskilda isolat då detta anses motiverat. RAF-M hänvisar till Biodisks rekommendationer för handhavande.

I det följande beskrivs det sätt på vilket RAF-M använt Etest^® då i framtagande av MIC-distributioner (se exempel för ampicillin) för RAF-boken.

1. Basic medium
2. Preparation of medium and plates
3. Preparation of inoculum
4. Handling of Etest
5. Incubation
6. Reading results
7. Comments

Etest^® is a commercially available product for the determination of antibiotic MIC-values (AB Biodisk, Solna, Sweden). The antibiotic in question has been applied on the backside of a plastic strip in such a way that a predefined concentration gradient, most commonly 0,016 - 256 mg/l, is achieved. The strip is placed on an agar plate inoculated with bacteria and after incubation the result is read as the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antibiotic (mg/l). The method has been compared with agar and broth dilution methods and provided medium, inoculum,  pH, incubation atmosphere and time were standardized the Etest was shown to give corresponding and reproducible results.

For using Etest^® in the clinical situation SRGA-M refers to the manuals of AB Biodisk.

In the following SRGA-M describes the way the Etest^® was used to make the MIC-distributions included in MIC-breakpoint tables (see example for  ampicillin).

Beredning av inokulat

Följ tillverkarens rekommendationer för beredning av inokulat  (0.5 McFarland för aeroba bakterier och 1.0 McFarland för anaeroba bakterier - Etest technical guide 3B). Härigenom fås ett inokulat som ger nästintill konfluerande växt till skillnad från det glesare inokulat som rekommenderas för diskdiffusion (för bakterier utan resistensmekanismer är det avlästa MIC-värdet oberoende av inokulatets täthet inom ett brett område, och fördelen med det tätare inokulatet som rekommenderas av tillverkaren är att avläsningen oftast är lättare att göra).

Preparation of inoculum

Prepare the inoculum according to the instructions of the manufacturer (0.5 McFarland for aerobic bacteria and 1.0 McFarland for anaerobic bacteria - Etest technical guide 3B). This inoculum yields next to confluent growth as opposed to the less dense inoculum recommended for SRGA disk diffusion method. The heavier inoculum provides results that are easier to read.

Hantering av Etest

Hantera Etest-remsor enligt tillverkarens instruktioner. Förvara dem i lufttäta behållare med torkmedel och låt dem anta rumstemperatur innan de öppnas.

Handling of the Etest

Handle the Etest strips according to the instructions of the producer. Keep them in airtight jars with silica gel and let them attain room temperature before the jar is opened.

Inkubering

Plattor med Etest inkuberas vid 35-37^o C i 24 timmar (för vissa arter längre tid, upp till 72 timmar) i den miljö som anges för respektive bakterieart.

Incubation

Plates with Etest strips should be incubated at 35-37^o C in air, CO₂, Campypac®- or in anaerobic atmosphere for 24 - 72 h depending on species and antibiotic.

Avläsning av resultat

Gör en bedömning av bakterieinokulat och tillväxt före avläsning. Läs MIC vid skärningspunkten växt/icke växt och Etest-remsan. Använd gärna lupp för att inspektera plattan och läs MIC vid fullständig hämning av växt (se Etest technical guide 3B).

På Etest-remsan anges även koncentrationer motsvarande "halva spädningssteg".  Vi rekommenderar att man vid avläsning av Etest alltid höjer ett "halvt" värde till närmaste högre "hela" spädningssteg: 0,002 - 0,004 - 0,008 - 0,016 - 0,032 - 0,064 - 0,125 - 0,25 - 0,5 - 1 - 2 - 4 - 8 - 16 - 32 - 64 - 128 - 256 mg/l. Härigenom får man en anpassning till SIR-systemets definitioner för känslighetsgrupper och till internationell terminologi att ange MIC-värden som hela spädningssteg i en skala där koncentrationen 1.0 mg/l alltid ingår.

Obs! På Etest för kombinationen trimetoprim+sulfametoxazol anges bara koncentrationen av trimetoprim. De båda komponenterna förekommer i proportionerna 1+19, och avläst värde måste därför multipliceras med 20 för att resultatet skall motsvara MIC av kombinationen. Ex. Avläst värde 0,5 (trimetoprim) betyder MIC 10 av trim+sulfa (anges ofta 0,5/9,5 i amerikanska dokument). 

Reading of results

Start by inspecting the inoculum. Read the MIC where inhibiton growth merges with the strip at the sharp end of the pear-shaped inhibition zone. Using a magnifying glass may help to identify the point where complete inhibition has been achieved which is where the MIC should be read (se Etest technical guide 3B).

On the Etest strip both whole- and half-step concentrations are indicated. The SRGA recommends that half-step concentrations are disregarded - always read the nearest higher concentration of the concentration series:  0,002 - 0,004 - 0,008 - 0,016 - 0,032 - 0,064 - 0,125 - 0,25 - 0,5 - 1 - 2 - 4 - 8 - 16 - 32 - 64 - 128 - 256 mg/l.
Neither the the biological variation nor the reproducibility permit the degree of sophistication indicated by the half-step concentrations.

International terminology requires a two-fold dilution concentration series containing the concentration 1.0 mg/l.

Nb. The Etest strip for trimethoprim-sulfamethoxazole displays only trimethoprim concentrations. The two components are present in a relation of 1+19 and all readings must be multiplied by 20 to correspond to the MIC-value of the combination. For example, a reading of 0.5 mg/l (trimethoprim) corresponds to 0.5 trimethoprim + 9.5 sulfamethoxazole (often reported as cotrimoxazole MIC 0.5/9.5 mg/l in international nomenclature).

Kommentarer

I de flesta situationer där resistensbestämning av ett bakterieisolat önskas fungerar diskdiffusionsmetoden tillfredsställande och ger avsedd SIR-klassificering. Etest är ett lämpligt komplement för bakteriearter som förekommer sällan eller för vilka det saknas väl underbyggda tolkningsunderlag för diskdiffusionsmetoden.

Comments

The opinion of the SRGA is that the Etest is an important complement to disk diffusion susceptibility testing. It allows laboratories who would not normally attempt MIC-determination of a single isolate to do so. This permits us to recommend that  disk diffusion screening methods for certain resistance mechanisms (eg. betalactam resistance in S.pneumoniae and H.influenzae) be followed by Etest MIC-determination rather than by further disk testing.

We would like to stress that although the Etest methodology "looks simple" it is not. It requires the same amount of standardization as other diffusion methods - otherwise it will produce neither correct nor reproducible results.