Disk diffusion (RAF)

Disk diffusion (SRGA)

1. Grundmedium
2. Medium med hästblod och NAD - medium B
3. Medium för anaeroba bakterier - medium B
4. Beredning av medium och agarplattor
5. Beredning av inokulat
6. Hantering av lappar
7. Prediffusion och inkubering
8. Registrering av hämningszoner
9. Val av antibiotika i resistensbesked

Resistensbestämning med disk diffusion kan med god standardisering och artrelaterade brytpunkter utföras med god reproducerbarhet.

1. Basic medium - medium A
2. Basic medium with horseblood and NAD - medium B
3. Basic medium for anaerobes - medium B
4. Preparation of media and plates
5. Preparation of inoculum
6. Handling of paper disks
7. Prediffusion and incubation
8. Measuring zone diameters
9. Choice of antibiotics to be investigated
   

Susceptibility testing with disk diffusion can be performed with excellent reproducibility provided a standardized methodology is used in combination with zone breakpoints that take into account that there are important differences between species (species related breakpoints).

1. Grundmedium - medium A i tabeller

Ett bra medium tillåter god växt av de flesta patogena bakterier, uppvisar liten variation mellan olika tillverkningssatser, innehåller låga koncentrationer av inhibitorer (ex tymidin eller tymin vid bestämning av trimetoprim) och en standardiserad halt av divalenta katjoner (påverkar aminoglykosiders aktivitet) samt ha en god buffertkapacitet och därmed stabila pH under inkubation och mellan tillverkningsbatcher. Det ska kunna supplementeras med olika tillväxtfaktorer, blod, blodprodukter mm.

Flera medier finns tillgängliga, t ex. Mueller Hinton (många fabrikat), Iso-Sensitest agar (Oxoid Ltd). RAF baserar sina zondistributioner, brytpunkter mm på ett medium, ISA från Oxoid.

RAF-M rekommenderar:

• Iso-Sensitest Agar (ISA) från Oxoid Ltd, Basingstoke, England
• PDM från Biodisk går ur produktion december, 2003.

1. Basic medium - medium A in tables

A good medium should allow abundant growth of relevant pathogens. It should exhibit a minimum of batch variation and should contain controlled and minimum amounts of inhibitors (thymine, thymidine and others) and controlled amounts of divalent cations (affects aminoglycoside activity). It should have a good buffering capacity to ensure stable pH during incubation also in CO₂. The medium should allow additives such as whole blood and blood products.

There are several media available from a number of manufacturers (Mueller-Hinton, ISA etc). The SRGA has chosen to base its zone diameter distributions and breakpoints on ISA, Oxoid.

The SRGA recommends:

• Iso-Sensitest Agar (ISA) from Oxoid Ltd, Basingstoke, United Kingdom
• PDM medium from Biodisk is removed from production december, 2003.

2. Medium med defibrinerat hästblod och NAD - medium B i tabeller

Grundmedium: ISA (Oxoid)
Tillsats: 5 % skakhästblod med 20 mg/L av b-nicotinamide adenine dinucleotide (b-NAD) renhetsgrad >98% (leverantörer, se nedan).

b-NAD kan köpas från Mast Diagnostics Merseyside, UK (via LabKemi Order Code SV82; förpackat i ampuller - 10 per förpackning, 1 ampull per liter medium) och från ICN (via Labora, katalognr 100499; 1g, 5g eller 10g; laboratoriet löser, filtrerar och fördelar i rör för frysning). 
Obs! b-NAD från några leverantörer har visat sig ge dålig växt av H.influenzae.

1. Väg upp ISA och blanda pulver och avjoniserat vatten i agarkokaren.
2. Autoklavera i 121° C i 15 minuter
3. Låt svalna till 50° C
4. Tillsätt b-NAD lösning 20mg/L och rumstempererat defibrinerat hästblod 5 %.
5. Gjut 25 ml i petriskålar.

Referenser: Detta medium rekommenderas sedan länge av BSAC. För Streptokocker, Pneumokocker, H.influenzae och M.catarrhalis. RAF-M gjort en jämförelse med de hittills använda medierna Hästblodplattan (för streptokocker och respektive IsoVitaleX-plattan och funnit att ISA med NAD kan ersätta båda dessa medier. Jämförelsen har presenterats som poster vid ECCMID i Glasgow 2003.

2. Medium with defibrinated horse blood
and NAD - medium B in tables

Basic medium: ISA (Oxoid).
Additive: 5 % defibrinated horseblood with 20 mg/L of  b-nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) purity >98% (manufacturers, see below).  

b-NAD from Mast Diagnostics Merseyside, UK (prepared in ampoules - 1 ampoule per 1 L of medium) and from ICN (1, 5 and 10 g batches available) gave good results in the hands of SRGA-M, whilst b-NAD from some manufacturers yielded poor growth of H.influenzae. 

One hundred 9 cm plates are prepared as follows:

• Destillated water 2500 ml
• Defibrinated horseblood 125 ml
• ISA (Oxoid) 78.5 g
• b-nicotinamide adenine dinucleotide 50 mg 

Preparation of medium:  

1. Basic medium (ISA) is prepared according to the instructions of the manufacturer. 
2. Autoclave at 121° C  for 15 minutes. 
3. Let the agar cool to 50° C.
4. Add b-NAD solution 20 mg/L and room temperature defibrinated horseblood.
5. Poor 25 ml in 9 cm plates.

Usage:  Antimicrobial susceptibility testing of Streptococci, pneumococci and Haemophilus spp, Moraxella catarrhalis, Pasteurella multocida, Neisseria gonorrhoeae (screen for betalactamase and quinolone resistance with a nalidixic acid 30 µg disc: zone/no zone).

Storage: 1 month refrigerated; plastic bags not necessary.

References: This medium is recommended by the BSAC working party on Antimicrobial Susceptibility Testing. The SRGA has made an extensive comparison of the NAD-medium on one hand and the IsoVitaleX for H.influenzae and the plate containing defibrinated horse blood for streptococci and pneumococci on the other. The comparison was presented as a poster at ECCMID in Glasgow, 2003.

3. Medium för anaeroba bakterier  - 
medium B i tabeller.

Detta medium är identiskt med medium B (se ovan) men inkubationen sker i 37C anaerob miljö varvid skall påminnas om att kvaliteteten på den anaeroba miljön påverkar zonstorleken mer än mycket annat. Mediet valideras nu (2003/2004) för snabbväxande anaeroba bakterier (Bacteroides och Clostridier).

3. Medium for anaerobic bacteria -
medium B in tables.

This medium is identical to medium B but it is incubated at 37C in anaerobic athmosphere. The quality of the anaerobic atmosphere influences zone diameters greatly.

4. Beredning av medium och agarplattor

Medium skall beredas enligt tillverkarens instruktioner. 

Mediets pH bör vara 7.4 (7.2-7.6) mätt med ytelektrod på agarytan vid rumstemperatur. Om mediet har supplementerats bör pH kontrolleras efter det att tillsatsen gjorts. 

Agarplattor beredes omgående. Omsmältning av basagar får ej förekomma.

Plattor gjuts med 25 ml/ 9 cm platta eller 60 ml/ 14 cm platta, så att agardjupet blir 4 mm ± 0.5 mm. Detta kan kontrolleras med den utskjutande piggen i skaftet på skjutmåttet.

4. Preparation of medium and agar plates

Media should be prepared in strict accordance with the instructions of the producer. 

The pH of the finished medium should be 7.4 (and kept within 7.2 - 7.6) and should be measured with a surface electrode at room temperature. If the medium contains additives the pH should be checked on the finished medium.

Agar plates should be poured immediately. SRGA-M discourages remelting of agar.

Plates are made with 25 ml/9 cm or 60 ml/14 cm plate which should produce an agar depth of 4± 0.5 mm.

5. Beredning av inokulat

Båda inokulaten i figuren är godkända, det glesa till vänster och det täta till höger. Inokulaten bör dock (om ej annat särskilt anges) vara varken glesare eller tätare. Ytterligare ett exempel på ett rekommenderat inokulum ges här!

5. Preparation of inocula

Both inocula are acceptable but should normally not be less confluent than the one to the left or more confluent (unless specified) than the one to the right. One more example of an SRGA recommended inoculum is given here!

Bered inokulatet enligt följande beskrivning men kontrollera därefter att tätheten i insådden följer rekommendationen (se bilden ovan):

Med en ögla nuddas 5-10 kolonier (för att få ett genetiskt representativt material) och slammas i 1 ml PBS-buffert. Denna suspension skall motsvara tätheten McFarland 0.5 (Suspension A).

• Generell metod användes om inte annat specificerats: Suspension A spädes 1/100 i PBS (1 drp, dvs 50 µl, till 5 ml). Detta ger ett inoculat på 10⁶ cfu/ml.
• Streptokocker inklusive S.pneumoniae:  Suspension A spädes 1/20 i PBS (1 drp, dvs 50 µl, till 1 ml);
• Corynebacterier: Suspension A spädes 1/50 i PBS (2 drp, dvs 100 µl, till 5 ml);

Nyberett inokulat bör användas inom 30 minuter. Inokulatet appliceras med svabbning, varvid en bomullspinne doppas i suspensionen, överskottet av vätska avlägsnas från pinnen genom att pressa den lätt mot röret, och bakterierna fördelas jämnt över agarytan exempelvis genom att bomullspinnen för hand stryks tätt i flera riktningar. Plattan behöver därefter ej torkas.

Ett alternativt sätt är att applicera inokulatet genom flödning av agarytan varefter överskottet av vätska avlägsnas. Därefter torkas agarytan vid 37 C så kort tid som möjligt (10-15 minuter). Det senare förfarandet ger tätare insådd än svabbning vid användning av samma bakteriesuspension.

Prepare the inoculum as described below but check the density of the inoculum against the recommendation (see figure above).

Touch 5 - 10 colonies with a sterile loop and suspend in 1 ml of phosphate-buffered saline (PBS). Depending on the species this should produce a suspension of bacteria with a density of approximately McFarland 0,5 (Suspension A).

• Unless otherwise specified: dilute Suspension A 1/100 in PBS (add 1 drop (50 µl) to 5 ml) which yields an inoculum of 10⁶ cfu/ml.
• Suspension A 1/20 in PBS (add 1 drop (50 µl) to 1 ml) which yields an inoculum of 10^6-7 (the inoculum is still within the ramifications delineated in the figure above)
• Corynebacteria: dilute Suspension A 1/50 in PBS (add 2 drops (100 µl) to 5 ml) which yields an inoculum of 10^6-7

Prepared inocula should be used within 30 minutes. The inoculum is applied to the plate by swabbing. Dip a cottontipped swab into the prepared inoculum and remove excess fluid by gently rolling the cotton swab against the wall of tube. Move the tip of the swab back and forth over the plate in at least two different directions. The plate does not need drying before antibiotic discs are placed on the surface.
An alternative way of applying the inoculum is by flooding the plate. Excess fluid is sucked off and the plate is allowed to dry (10 - 15 minutes at 37^o C). Using the same preparations as those described above will result in slightly denser inocula.

6. Hantering av lappar

Antibiotikalappar appliceras på inokulerad agaryta inom 30 minuter. De appliceras manuellt eller med applikator så att avståndet mellan dem är minst 30 mm. Var noga med att lapparna får god kontakt med agarytan. Antibiotikalappar skall förvaras och hanteras enligt tillverkarens föreskrifter. Lappar innehållande betalaktamantibiotika är särskilt känsliga för felaktig hantering.

6. Handling of antibiotic disks

Antibiotic disks should be stored and handled as instructed by the producer. In our experience disks that are correctly handled rarely fail.
Antibiotic disks are placed (manually or with an applicator) evenly spaced on the agar surface within 30 minutes of preparing the inoculum. Make sure the disks have adequate contact with the agar surface.

7. Prediffusion och inkubering

Efter insådd och applikation av lappar skall plattorna lämnas minst 30 och högst 60 minuter i rumstemperatur före inkubering. Härigenom bildas en stabil gradient av antibiotikum i agarn innan bakterietillväxten börjar. Plattorna inkuberas vid 37 C i 16-20 timmar. Vissa bakterier, t ex Haemophilus, Neisseria och streptokocker bör inkuberas vid 37^o C i 5% CO₂-atmosfär.

7. Prediffusion and incubation

Inoculated plates should preferably be left at room temperature for a minimum of 30 and maximum 60 minutes prior to incubation. Thereby a stable gradient of antibiotic is created before bacterial growth starts. Plates are normally incubated at 35^o - 37^o C for no less than 16 and no more than 20 hours. Haemophilus, Neisseria and streptococci should be incubated in 5 % CO₂ in air). It is important that the atmosphere is not varied and that incubators are checked regularly as to their temperature and atmosphere.

8. Registrering av hämningszoner

Gör en bedömning av bakterieinokulatet före avläsning av hämningszonerna:

För att uppnå reproducerbara resultat är det framför allt viktigt att inokulatet inte blir för tätt. Bakteriekolonierna skall vara "tätt stående men ej sammanflytande". Det är viktigare att de ej sammanflyter än att de är tätt stående.

Ett för "tjockt" inokulat ger mindre zoner, vilket kan medföra en felaktig tolkning av bakteriens känslighet. Ett "glest" inokulat har mindre effekt på zonens storlek med mindre risk för feltolkning.

Hämningszonens diameter avläses med skjutmått eller motsvarande hjälpmedel. Om zongränsen är diffus görs avläsningen vid övergången mellan kraftig växt och avsaknad av växt (ca 80 % hämning). Hämningszonen avrundas till närmaste hela mm-tal. Med ledning av hämningszonens storlek kan isolatet känslighetsgrupperas med hjälp av RAF:s artrelaterade zonbrytpunkter.

Meticillinresistens hos S.aureus och kromosomalt betingad betalaktamresistens hos H.influenzae kan visa sig som enstaka kolonier eller som en tunn hinna av växt i hämningszonen runt betalaktam-lappen. Det kan vara uttryck för att endast en liten del av populationen uttrycker resistensen men isolatet skall trots det klassificeras som R. För dessa resistensmekanismer och hos VRE är det viktigt att notera inte bara zonens storlek utan också avvikande utseenden.   

8. Measuring inhibition zone diameter

Before measuring the zone diameters make sure the inoculum is not too dense. Next-to-confluent growth is accepted but never confluent growth. 

The diameter of the inhibition zone is measured to the nearest millimetre with a pair of calipers or another suitable tool. If the zone border is diffuse the zone should normally be read where 80 % inhibition is achieved. Interprete the zone diameter using the SRGA zone breakpoint tables.

It is important to look for single colonies within the inhibition zone. Single colonies may represent a resistance mechanism expressed only by a minor part of the population (e.g. methicillin resistance in staphylococci) in which case the isolate should be classified as "Resistant".  Methicillin resistance in staphylococci and non-betalactamase dependent betalactam resistance in H.influenzae can also appear as thin growth within the zone (oxacillin 1 µg disk and penicillin V 10 µg disk, respectively)

9. Val av antibiotika i resistensbesked

Ett förslag till minimiurval av antibiotika, som är relaterat till infektionens lokalisation och infektiöst agens har nyligen uppdaterats av RAF/RAF-M.  

9. Choice of antibiotics to be tested

The SRGA gives suggestions for minimum selections of antibiotics to be tested in different situations. However, they are adapted to Swedish traditions and resistance rates. Local, regional or national differences in this respect should be followed.

2003-11-10

2003-11-10