Påvisande av specifika resistensgener |
Detection of resistance genes |
| 1. Allmänt 2. PCR-reaktion 3. MRSA: påvisande av mecA-gen med PCR 4. VRE: påvisande av van-gener med PCR 5. Kommentarer 6. Referenser |
1. General information 2. PCR-reaction 3. MRSA: detection of the mecA-gene with PCR 4. VRE: detection of van-genes with PCR 5. Comments 6. References |
Resistens hos en bakterie mot ett antibiotikum bestäms vanligen med en fenotypisk metod, dvs diskdiffusion eller en MIC-bestämningsmetod. Fenotypiska metoder ger besked om effekten av olika resistensmekanismer i kvantitativa termer (diametern av hämningszonen respektive minsta hämmande koncentrationen). De kan däremot inte tala om vilken typ av resistensmekanism som har gett denna effekt. För de flesta tillfällen är fenotypiska metoder tillräckliga för att avgöra om en bakterie är känslig eller resistent mot ett visst antibiotikum. Påvisande av antibiotikainaktiverande enzym är en kvalitativ test (Ja/Nej) som i vissa fall är utslagsgivande vid bedömning av resistens. Detta gäller påvisande av betalaktamas hos gonokocker, stafylokocker, Haemophilus influenzae och Moraxella catarrhalis. Man påvisar då produkten av en resistensgen. Man kan gå ett steg längre genom att påvisa den gen (eller specifik sekvens av en gen) som ger upphov till det protein som orsakar resistens. PCR-metodik är då ett lämpligt verktyg för att snabbt få besked om den genetiska bakgrunden till resistens. Den är ett viktigt supplement till fenotypiska metoder, t ex för verifiering av meticillinresistens hos stafylokocker och vankomycinresistens hos enterokocker. |
General information Antibiotic resistance is generally determined by a phenotypic method, i.e. disk diffusi or an MIC method. Phenotypic methods give quantitative information about the effect of different mechanisms of resistance (the diameter of an inhibition zone or a MIC value), but they do not indicate which kind of mechanism is involved. On most occasions phenotypic methods are sufficient for the discrimination between susceptible and resistant micro-organisms. Detection of an enzyme that is able to inactivate an antibiotic is a qualitative method (Yes/No) which under special circumstances determines whether or not an isolate is resistant to an antibiotic. This is the case for detection of betalactamase in gonococci, staphylococci, Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis. The product of a specific gene is then detected. One step further would be to detect the gene (or a specific sequence of the gene) which codes for the protein/enzyme giving rise to resistance. PCR methods are useful tools for the rapid determination of the genetic background of resistance. They are important supplements to phenotypic methods, e.g. for the verification of methicillin resistance in staphylococci and vancomycin resistance in enterococci. |
PCR-reaktion PCR står för Polymerase Chain Reaction och är en metod för att förstärka fragment av DNA. Specifikt för varje gen som avses tillverkas syntetiskt ett par av oligonukleotider (primers) vilka basparar till kända sekvenser av den sökta genen. Till en reaktionsblandning som inehåller fria nukleotider, primerpar och DNA från bakterieceller tillsätts ett värmestabilt DNA-polymeras. Detta enzym katalyserar DNA-syntes från 3'-ändarna av basparad primer. PCR-reaktionen består av tre steg, denaturering (delning) av dubbelsträngat DNA till enkelsträngat, primerbasparning och DNA-syntes. Varje steg sker vid olika temperaturer och upprepas ett antal gånger, s k temperaturcykler. För detta används ett instrument som närmast kan beskrivas som ett programmerbart värmeblock. För varje temperaturcykel ökar antalet DNA-fragment exponentiellt. Amplifierade DNA-fragment samt en storleksmarkör (DNA-stege) separeras genom gel-elektrofores varefter de infärgas med etidiumbromid (EtBr) som interkalerar med DNA. EtBr fluorescerar vid UV-belysning varpå DNA kan ses som band i gelen. De separerade banden dokumenteras med fotografering. Det bildade fragmentets storlek är beroende av avståndet på genomet mellan platserna där primersekvenserna basparar. Storleken på det band som erhållits jämförs med DNA-stegens band av känd storlek. Bakterieisolat som ger upphov till band som motsvarar beräknad storlek tolkas som positiva för den sökta genen. Metoden är kvalitativ. |
The PCR reaction PCR means Polymearase Chain Reaction and is a method for multiplying DNA fragments. For a gene, or part of a gene, that you want to detect you need a pair of short oligonucleotide chains ( so called primers) which correspond to known sequences of the gene. To a reaction mixture containing free nucleotides, the two primers, and DNA prepared from the isolate under investigation, is added a heat-stable DNA polymerase. This enzyme catalyses the reaction of DNA synthesis from the 3´end of each of the primers. The PCR reaction consists of three steps, denaturation of double stranded to single stranded template DNA, coupling of the primers to specific sites of single-stranded DNA, and synthesis of DNA. Every reaction step proceeds at a specific temperature and is repeated several times, so called cycles. The instrument used for the PCR reaction is simply described as a programmable heating block. The newly synthesised and amplified DNA fragment is compared to DNA fragments of known sizes (DNA ladder) in an electrophoretic separation and detected by the use of ethidium bromide (EtBr), which intercalates with DNA. EtBr is fluorescent under UV light, and the DNA fragment is seen as a single band of the expected size. The size is dependent on the distance between the two primer binding sites on the genome. Bacterial isolates giving rise to PCR products of the right size are interpreted as carrying the analysed gene. This method is qualitative. |
MRSA: påvisande av mecA-gen med PCR Förekomst av meticillinresistens hos Staphylococcus aureus (MRSA) utgör ett kliniskt och epidemiologiskt problem på sjukhus. Vid misstanke om MRSA är det därför viktigt att försäkra sig om korrekt artidentifikation i samband med konfirmation av mecA-genen. S.aureus är positiva i rörkoagulas och bildar ett termostabilt nukleas (TNas) som kodas av nuc-genen. Både mecA- och nuc-genen kan samtidigt påvisas med PCR (1). |
MRSA: detection of the mecA gene by PCR Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are related to clinical and epidemiological problems in hospitals. When MRSA are suspected it is therefore important to ensure that the species identification is correct. S.aureus are coagulase positive and produce a thermostable nuclease, which is encoded by the nuc gene. The mecA and the nuc gene can be detected simultaneously using PCR (1). |
VRE: påvisande av vanA-, vanB, vanC1-, vanC2,3-gener med PCR Vankomycinresistens hos enterokocker förekommer dels som naturlig (intrinsic), dels som förvärvad resistens. PCR-metoder, med lämpliga sekvenser för primerpar, för påvisande av de olika generna som ger upphov till vankomycinresistens, samt PCR för artidentifiering av E.faecalis och E.faecium, finns beskrivna (2). |
VRE: detection of vanA, vanB, vanC1, vanC2,3 genes using PCR Resistance to vancomycin in enterococci is either intrinsic (vanC genes. in E.gallinarum, E.casseliflavus) or aqcuired (vanA or vanB genes mainly in E.faecium and E.faecalis). PCR methods suggesting primer sequences for the detection of all of these genes have been published (2). |
PCR-metoder för många andra välkarakteriserade resistensmekanismer finns också beskrivna i litteraturen. Det gäller betalaktamresistens orsakad av betalaktamaser, aminoglykosid-resistens orsakad av inaktiverande enzym, makrolidresistens hos olika arter (t ex H.pylori) med flera. I dessa fall är dock fenotypiska metoder tillräckliga för att särskilja en resistent population från den känsliga, och en exakt identifiering av resistensmekanismen ej nödvändig för det kliniska handläggandet. |
Comments PCR methods have been described for many other well characterised mechanisms of resistance as well. Examples are betalactam resistance caused by betalactamases, aminoglycoside resistance caused by inactivating enzymes, and macrolide resistance in different genera (streptococci, H.pylori). In many of these cases the phenotypic methods routinely used are often enough to discriminate between susceptible and resistant isolates, and the clinical considerations are not immediately dependent on the characterization of the resistance mechanism. |
|
References
|
Barbro Olsson-Liljequist & Anki Petersson RAF & RAF-M, 1997 |
Barbro Olsson-Liljequist & Anki Petersson SRGA & SRGA-M, 1997 |