Påvisande av betalaktamas

1. Penicillinas detektion
   - test med kromogent cefalosporin
2. ESBL-detektion
   - synergitest med lappdiffusion
   - synergitest med Etest
3. Metallobetalaktamaser
   - synergitest med lappdiffusion
   - synergitest med Etest

Detection of betalactamase

1. Penicillinase detetction
   - detection using chromogenic cephalosporin
2. ESBL-detection
   - synergy testing with disk diffusion
   - synergy testing with Etest
3. Metallobetalaktamase
   - synergy testing with disk diffusion
   - synergy testing with  Etest

I nedanstående text görs en tydlig skillnad på tester för "detektion" och "konfirmation" (eller karakterisering) av betalaktamaser.

The following text makes a clear distinction between "detection" and "confirmation" (or characterization") of betalactamases.

Detektion av betalaktamasproduktion med kromogent cefalosporin (nitrocefintesten).

• Antibiotika: Nitrocefindisk (AB Biodisk, Oxoid)

Metod

• Princip: Nitrocefin är ett kromogent cefalosporin som kan hydrolyseras av både penicillinaser och cefalosporinaser. Substansen är ursprungligen gul men efter spjälkning av betalaktam-ringen ändrar den färg till rött.
• Utförande: Fukta nitrocefin-disken och stryk bakterien med ögla på denna. Undvik att lägga lappen på substrat innehållande blodprodukter, vilket kan ge falskt positiv reaktion.
• Avläsning: Notera färgomslag från gult till rött.

Tolkning

• Momentant färgomslag (maxtid före avläsning 5 minuter) ses hos enzymproducerande isolat av H. influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, E. faecalis och inducerade S. aureus.

• Hos andra arter är reaktionen långsammare och kan avläsas inom 30 minuter.

Kvalitetskontroll

• TEM-1: H. influenazae CCUG 23969
• BRO-1: M. catarrhalis CCUG 18284
• Svagt positiv nitrocefinreaktion: S. aureus ATCC 29213
• Starkt positiv nitrocefinreaktion: S. aureus CCUG 35602
• Negativ kontroll: Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069

Begränsningar

• S. aureus måste induceras med t ex 0,01 mg/L oxacillin (ta kolonier från periferin av zonen) innan testning
• S. saprophyticus ger en svag positiv, falsk reaktion med nitrocefintesten.

Detection of beta-lactamase with chromogenic cephalosporin (nitrocefintest).
 

• Antibiotic: Nitrocefindisk (AB Biodisk, Oxoid)

Method

• Principle: Nitrocefin is a cephalosporin which is readily hydrolysed by most kinds of betalactamases. Hydrolysis of the betalactam bond results in a change of colour from yellow to red.
• Utförande: The nitrocefin-disk is moisturised and the bacterium inoculated on the disk. Avoid placing the disk on a substrate containing blood.
• Reading: Positive test is a colour change from yellow to red.

Interpretation

• Immediate colour change (maximum 5 min before reading) can be observed in enzyme producing isolates of H.influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, E. faecalis and induced S. aureus.
• In other microorganisms the reaction may take up to 30 minutes.

Quality control

• TEM-1: H. influenazae CCUG 23969
• BRO-1: M. catarrhalis CCUG 18284
• Weak positive nitrocefin reaction: S. aureus ATCC 29213
• Positive nitrocefin reaction: S. aureus CCUG 35602
• Negative control: Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069

Limitations

• S. aureus must be induced (use oxacillin 0,01 mg/L (take colonies from the perophery of the zone) prior to testing.
• S. saprophyticus gives a weak false positive reaction.

Lappdiffusion (synergitest) för ESBL konfirmation hos Enterobacteriaceae

Medium: Iso-Sensitest agar utan tillsatser

Antibiotikalappar / kombinationslappar (Oxoid):
- cefpodoxim 10μg / CD01 cefpodoxim/klavulansyra (10/1 µg)
- ceftazidim 30μg / CD02 Ceftazidim/klavulansyra (30/10μg)
- cefotaxim 30 μg / CD03 Cefotaxim/klavulansyra (30/10μg)
- cefpirom 30 μg / CD04 Cefpirom/klavulansyra (30/7.5μg)

Metod

Inokulat: Turbiditet 0,5 McFarland standard appliceras på agarplattan utan spädning (CD01 är även validerat för 1:100 dilution). Korresponderande lappar (med och utan klavulansyra) appliceras på agarplattan med tillräckligt avstånd för att definierade inhibitionszoner kan bildas.

Inkubering: Aerobt 16-20 h vid 35˚ - 37˚ C

Tolkning:

• Generell tolkning: Med lapparna CD01, CD02 och CD03 räknas bakterien som ESBL-producerande om det med en eller flera lappar kan observeras en ökning i inhibitionszonen på ≥ 5 mm, jämfört med lappar innehållande enbart antibiotika.
  Undantag: Klebsiella oxytoca kan uppvisa en ökning av inhibitionszonen på ≥ 5 mm både för cefpodoxim (CD01) och cefotaxim (CD03) då dessa kombineras med klavulansyra. Enzymen hos Klebsiella oxytoca är artspecifika (OXY-1 eller OXY-2, kromosomalt medierade) och brukar därför inte räknas som ESBL. De hydrolyserar cefuroxim, aztreonam, i viss utsträckning cefotaxim och inte alls ceftazidim. Enstaka ceftazidim-resistenta isolat har identifierats, och dessa har visat sig ha både OXY-enzym och ESBL av CTX-M-typ.
• CD04 (cefpirom/cefpirom-klavulansyra): Lappen är utvecklad särskilt för Enterobacter species. Bakterien räknas som ESBL-producerande om det kan påvisas en ökning i inhibitionszonen på ≥ 4 mm, jämfört med lappar innehållande enbart antibiotika.
  Teorin bakom detta är att kromosomal betalaktamas, AmpC, i mycket liten grad påverkar cefpirom, varför man inte får en maskering av eventuell synergieffekt med klavulansyra.
• Stammar som uppvisar avvikande eller ovanligt mönster eller som inte kan karakteriseras av laboratoriet skickas till referenslaboratorium för verifiering med PCR och sekvensering.

Disk diffusion (synergy test) for ESBL confirmation in Enterobacteriaceae

Medium: Iso-Sensitest without additives

Antibiotic / combination discs (Oxoid):
- cefpodoxim 10μg / CD01 cefpodoxim/clavulanic acid (10/1 µg)
- ceftazidim 30μg / CD02 Ceftazidim/clavulanic acid (30/10μg)
- cefotaxim 30 μg / CD03 Cefotaxim/clavulanic acid (30/10μg)
- cefpirom 30 μg / CD04 Cefpirom/clavulanic acid  (30/7.5μg)

Method

Inoculum: Turbidity 0,5 McFarland standard is inoculated directly onto the agar plate. Paired disks with and without clavulanic acid are placed on the agar surface at a sufficient distance from each other to allow inhibition zones of 20-30 mm for each disk.
 

Incubation: Ambient air 16-20 h at 35˚ - 37˚ C.

Interpretation

• General interpretation: With CD01, CD02 and CD03 the bacterium is considered ESBL-producing if a zone diameter increase of ≥ 5 mm is registered for one or several of the three disks.
  Exception: Klebsiella oxytoca can display an increase in inhibitionzone of ≥ 5 mm both for cefpodoxime (CD01) and cefotaxime (CD03) when these antibiotics are combined with clavulanic acid. The chromosomally located enzymes OXY-1 and OXY-2 are specific for Klebsiella oxytoca, and are therefore usually not regarded as ESBL. The enzymes can hydrolyse cefuroxime, aztreonam, and to some degree cefotaxime, but not ceftazidime.
• CD04 (cefpirome/cefpirome-clavulanic acid): this disk-combination is specifically developed for Enterobacter species. Bacteria belonging to this species are regarded as ESBL-producers if the inhibitionzone increases ≥ 4 mm with CD04 compared to cefpirome alone. The theory behind this test is that cefpirome to a very little extent is hydrolysed by chromosomal betalactamase, AmpC, and as a result the synergy effect with clavulanic acid is not masked.
• Strains showing unusual or deviant resistance patterns, or those that local laboratories are unable to characterize, should be sent to a reference laboratory for further investigation with PCR and sequencing.

Kommentar

Sensitivitet (%) och specificitet (%) för detektion av ESBL hos Escherichia coli och Klebsiella species med de olika metoderna (CD02-CD04) varierar (90 - 95 %) med vilka enzymer är som är vanliga.

Kombination av lapparna CD02 och CD03 rekommenderas för att täcka in substratprofil för de flesta ESBL-varianter.

För Enterobacter species har CD03 (cefotaxim) låg sensitivitet under det att en kombination av CD02 (ceftazidim) och CD04 (cefpirom) har mycket hög sensitivitet och specifictet. 

Comment

 Sensitivity and specificity for detection of ESBL in Escherichia coli and Klebsiella species with the different disk combinations (CD02-CD04) varies (90-95%) with type of ESBL.  

A combination of the disks CD02 and CD03 will cover most ESBL substrate profiles.

For Enterobacter species the sensitivity of CD03 (cefotaxime) is low , but excellent sensitivity and specificity can be achieved with a combination of CD02 (ceftazidime) and CD04 (cefpirome).

References:

• Oxoid-product description (www.oxoid.com)
• De Gheldre, Y. et al.  Evaluation of Oxoid combination discs for detection of extended-spectrum β-lactamases. 2003. J Antimicrob Chemother 52: 591-597.
• SWEDRES 2004

Etest för konfirmation av ESBL hos Enterobacteriaceae

Metod

Reagens - antibiotika/enzyminhibitor:
- Cefotaxim/cefotaxim + klavulansyra (4µg/ml),
- Ceftazidim/ceftazidim + klavulansyra (4µg/ml),
- Cefepim/cefepim + klavulansyra (4µg/ml)

Medium: Grundmedium bereds enligt instruktioner från tillverkaren. Mueller-Hinton agar utan tillsatser rekommenderas av tillverkaren. Tester utförda på IsoSensitest agar (Smittskyddsinstitutet) har också gett resultat som väl överensstämt med övriga fenotypiska och genotypiska metoder för detektion av ESBL.

Inokulat: Turbiditet 0,5 McFarland standard appliceras på agarplattan utan spädning. Etest appliceras efter 10 min torkning

Inkubering: Aerobt 16-20 h vid 35˚ - 37˚ C.

Avläsning: Läs MIC-värden för cefalosporin och cefalosporin+klavulansyra enligt tillverkarens instruktioner. Vid växt av kolonier i inhibitionszonen läses MIC där dessa upphör. Närvaro av fantomzon eller ellipsdeformation är båda tecken på ESBL produktion och orsakas av att klavulansyra diffunderar mot den del av Etest remsan som innehåller enbart antibiotika.

Etest for ESBL confirmation in Enterobacteriaceae

Method

Reagents - antibiotics/enzyme inhibitors:
- Cefotaxime/cefotaxime + clavulanic acid (4µg/ml),
- Ceftazidime/ceftazidime + clavulanic acid (4µg/ml),
- Cefepime/cefepime + clavulanic acid (4µg/ml)

Medium:  Medium is prepared according to manufacturers description. Mueller-Hinton agar without additives is recommended by the manufacturer.  Evaluation of IsoSensitest agar (at the Swedish Institute for Disease Control) have yielded results that correlate well to those obtained with Mueller-Hinton.

Inoculum: Turbidity 0,5 McFarland standard is inoculated directly onto the agar plate. Apply the Etest after 10 min of drying.

Incubation: Ambient air 16-20 h at 35˚ - 37˚ C.

Reading: Read MIC-values for cephalosporin/cephalosporin+clavulanic acid in accordance with the manufacturer’s instructions. Growth in inhibitionzones should be taken into account, and MIC should be read where such growth no longer is present. Presence of a phantom zone or ellipsedeformation are both signs of ESBL production and are caused by diffusion of clavulanic acid.

Tolkning

Ratio MIC cefalosporin/cefalosporin+klavulansyra ≥ 8 eller ≥3 log₂ spädningssteg räknas som tecken på ESBL-produktion.

Förekomst av fantomzon eller ellipsdeformation är tecken på ESBL produktion även om ratio antibiotika/antibiotika+klavulansyra < 8.

Interpretation

Ratio MIC cephalosporin/cephalosporin+ clavulanic acid ≥ 8 eller ≥ 3 log₂ dilutionsteps are considered signs of ESBL-production.

Presence of a phantom zone or ellipsedeformation are signs of ESBL-production, also if ratio cephalosporin/cephalosporin+ clavulanic acid < 8.

Kommentarer

Klebsiella oxytoca som producerar kromosomalt K1 betalaktamas kan i kombinationstesten med klavulansyra bli falskt positiv i ESBL testen när cefotaxim eller cefepim används, men inte med ceftazidim. Enzymen hos Klebsiella oxytoca är artspecifika (OXY-1 eller –2, alternativt K1) samt kromosomalt medierade och brukar därför inte räknas som ESBL. De hydrolyserar cefuroxim, aztreonam, i viss utsträckning cefotaxim men inte alls ceftazidim. Enstaka ceftazidim-resistenta isolat har identifierats (MIC > 16 mg/L), och dessa har visat sig ha både OXY-enzym och ESBL av CTX-M-typ.

Cefepim-klavulanat hade 100% sensitivitet för detektion av ESBL hos Enterobacter species och 98% sensitivitet för detektion hos Escherichia coli, Klebsiella species och Enterobacter species i en nyligen publicerad studie (Stürenburg JAC 2004) Cefepim och cefepim-klavulanat lämpar sig förutom hos K. oxytoca, därmed bra även ensam för ESBL-screening.

Stammar med cefalosporinresistens där ESBL-produktion uteslutits med klavulansyre synergi test (lapp eller Etest) kan undersökas på förekomst av AmpC hyperproduktion. Karakteristiskt för sådana stammar är högt MIC för cefoxitin samtidigt som de uppvisar normala eller nästan normala MIC-värden för 4:e generations cefalosporiner (cefepim). Hos Escherichia coli och Klebsiella pneumoniae kan dessa enzymer vara plasmidburna.

Comments

Klebsiella oxytoca producing chromosomal K1 betalactamase can become false positive in the ESBL test when cefotaxime or cefepime are used, but not when using ceftazidim.  The enzymes in Klebsiella oxytoca (OXY-1 or OXY-2, alternatively K1) are species-specific and chromosomally located.  They are therefore usually not regarded as ESBLs. The OXY-enzymes can hydrolyse cefuroxime, aztreonam, and to a certain extent cefotaxime, but not ceftazime. 

Cefepime-clavulanic acid had 100% sensitivity for detection of ESBL in Enterobacter species and 98% sensitivity for detection in Escherichia coli, Klebsiella species and Enterobacter species in a recent publication (Stürenburg, JAC 2004).  The cefepim/cefepim+clavulanic acid synergy test is therefore also useful as a stand-alone test for ESBL-detection.  The exception is Klebsiella oxytoca, because of the risk of false positives.

Strains with cephalosporin resistance but no clavulanic acid synergy can be tested phenotypically for AmpC hyperproduction. Characteristic for such strains is the high MIC values for cefoxitin in combination with low or moderately increased MICs for 4^th generation cephalosporins (cefepim). In Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae these enzymes can be plasmid mediated.

References

• Etest-product description (www.abbiodisk.se)
• Stürenburg, E. et al.  Evaluation of a new cefepime-clavulanate ESBL Etest to detect extended-spectrum β-lactamases in an Enterobacteriacae strain collection. 2004.  J Antimicrob Chemother 54: 134-138
• Coudron, P. E., E. S. Moland, and K. S. Thomson. 2000. Occurrence and detection of AmpC ß-lactamases among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center. J. Clin. Microbiol. 38:1791-1796.

 Lappdiffusion för detektion av metallobetalaktamas (MBL)  hos Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter species och Enterobacteriaceae

• Medium: Mueller-Hinton agar utan tillsatser. För Pseudomonas aeruginosa fungerar även IsoSensitest agar, men för övriga arter där enzymuttrycket är lägre fungerar endast Mueller-Hinton (pga för låg zink-halt i IsoSensitest agar).
• Antibiotika: Imipenem 10 μg lapp med tillsats av 140 μg zink-sulfat per lapp (i volym på 10 μL till varje lapp)
• Enzyminhibitor: EDTA 750 μg i 10 μL och SMA (sodium mercaptoacetic acid, Sigma) 2 mg i 10 μL tillsättas till lapp utan antibiotika

Metod

• Medium: Grundmedium bereds enligt instruktioner från tillverkaren
• Inokulat: Turbiditet 0,5 McFarland standard appliceras på agarplattan utan spädning. Antibiotikalapp och enzyminhibitorlapp appliceras med 10 mm avstånd (kant till kant)
• Inkubering: Aerobt 16-20 h vid 35˚ - 37˚ C
• Avläsning: Se efter deformation av inhibitionszon som indikerar synergism

Tolkning

• Om synergitest ger positivt resultat: gå vidare med konfirmationstest
• Analysen kan evt kompletteras med Etest (imipenem/imipenem+EDTA), se metodbeskrivning
• Skicka stam till referenslaboratorium för verifiering med PCR och sekvensering

Disk diffusion for detection of metallobetalactamase (MBL) in Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter species and Enterobacteriaceae

• Medium: Mueller-Hinton agar without  additives For Pseudomonas aeruginosa it is possible to use IsoSensitest agar. For other species, that usually have a lower enzyme expression, IsoSensitest agar is not possible to use (due to it’s comparably low zink-content). Antibiotic: Imipenem 10 μg disk to which 10 μL of a solution containing 140 μg zink-sulphate per 10 μL is added.

• Enzyminhibitor: EDTA 750 μg in 10 μL and SMA (sodium mercaptoacetic acid, Sigma) 2 mg in 10 μL added to a disk without the antibiotic.

Metod

• Medium: Prepare medium according to manufacturer’s instructions.
• Inoculum: Turbidity 0,5 McFarland standard is applied directly to the  agar.  Disk containg imipenem and imipenem+EDTA are placed with 10 mm distance (edge to edge)
• Incubation: Ambient air 16-20 h vid 35˚ - 37˚ C
• Reading: Look for deformation of inhibitionzone, which indicates synergy.

Interpretation

• If the synergy test is positive: continue with confirmatory testing
• Additonal testing with Etest (imipenem/imipenem+EDTA), see method describtion
• Send the isolate to a reference laboratory for verification with PCR and sequencing

References

• Lee, K., Lim, Y.S., Yong, D., Yum, J.H., Chong, Y.  Evaluation of the Hodge test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-beta-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol. 2003

Etest för detektion av metallobetalaktamas detektion

• Medium: Mueller-Hinton agar utan tillsatser. För de flesta Pseudomonas aeruginosa fungerar även IsoSensitest agar, men för övriga arter där enzymuttrycket är lägre fungerar endast Mueller-Hinton (pga för låg zink-halt i IsoSensitest agar).
• Antibiotika/enzyminhibitor: Etest med imipenem/imipenem+EDTA

Metod

• Medium: Grundmedium bereds enligt instruktioner från tillverkaren
• Inokulat: Turbiditet 0,5 McFarland standard appliceras på agarplattan utan spädning. Etest appliceras efter 10 min torkning
• Inkubering: Aerobt 16-20 h vid 35˚ - 37˚ C. I fall av sakta växande bakterier kan inkubationen förlängas till totalt 48 h
• Avläsning:  Läs av imipenem (IP) och imipenem+EDTA (IPI) MIC-värden där inhibitionsellipser skär Etest-rämsan.  Om mutant-kolonier finns med i ellipsen läser man MIC där dessa komplett inhiberas.  Närvaro av fantom-zon eller ellipsdeformation är båda tecken på MBL produktion och orsakas av att EDTA diffunderar från IPI mot IP

Tolkning:  

• Ratio MIC imipenem/imipenem-EDTA ≥ 8 eller ≥ 3 log₂ spädningssteg räknas som positiv screeningtest
• Skicka till referenslaboratorium för verifiering med PCR och sekvensering
• Falskt positivt screeningresultat förekommer ofta och beror förmodligen på en permeabiliserande effekt av EDTA

 Kvalitetskontroll

• Använd P. aeruginosa ATCC 27853 (MIC imipenem ≤ 4 mg/L, MIC imipenem+EDTA 1-4 mg/L)

Begränsningar

• Aeromonas species med låggradig produktion av MBL kan inte detekteras
• Stammar med gränsvärden bör undersökas på referenslaboratorium med PCR
• Säkra resultat kan bara garanteras med Mueller Hinton agar

Etest for detection of metallobetalactamase detection

• Medium: Mueller-Hinton agar without additives. For most Pseudomonas aeruginosa it is possible to use IsoSensitest agar. For other species, that usually have lower enzyme expression, IsoSensitest agar is not possible to use (due to it’s comparably low zink-content).
• Antibiotika/enzymeinhibitor: Etest with imipenem/imipenem+EDTA

Metod

• Medium: Prepare medium according to manufacturer’s instructions.
• Inoculate: Turbidity 0,5 McFarland standard is inoculated directly onto the agar plate. Etest is applied after 10 min of drying.
• Incubation:  Ambient air 16-20 h at 35˚ - 37˚ C . In case of slow growing organisms, the incubation can be prolonged to 48 h
• Reading:  Read MIC-values for cephalosporin/cephalosporin+clavulanic acid in accordance with the manufacturer’s instructions. Growth in inhibitionzones should be taken into account, and MIC should be read where such growth no longer is present. Presence of a phantom zone or ellipsedeformation are both signs of ESBL production and are caused by EDTA diffusing from IPI mot IP

Interpretation:  

• Ratio MIC imipenem/imipenem-EDTA ≥ 8 or ≥ 3 log₂ dilution steps are considered a positive screening test
• Send the isolate to a reference laboratory for PCR and sequencing.
• False positive screeningresults are frequently observed, and are most likely due to a permeabilizing effect of EDTA

 Quality control

• Use P. aeruginosa ATCC 27853 (MIC imipenem ≤ 4 mg/L, MIC imipenem+EDTA 1-4 mg/L)

Limitations 

• Aeromonas species with lowgrade production of MBL cannot be detected
• Isolates with borderline screening results should be examinated in a referencelaboratory
• Accurate results can only by guaranteed with usage of Mueller-Hinton agar

Referenser

• Etest-product description (www.abbiodisk.se)
• Walsh, T.R., Bolmstrom, A., Qwarnstrom, A., Gales, A.. Evaluation of a new Etest for detecting metallo-beta-lactamases in routine clinical testing. J Clin Microbiol. 2002 Aug;40(8):2755-9.