Validering och intern kvalitetskontroll av resistensbestämning

Validation and internal quality control of antibiotic susceptibility testing

1. Validering av resistensbestämning med histogramanalys av konsekutiva kliniska isolat.
2. Intern kvalitetssäkring med referensstammar

1. Validation of susceptibility testing with  histogram analysis of consecutive clinical isolates.
2. Internal quality control with reference strains

1. Validering av resistensbestämning med histogramanalys av konsekutiva kliniska isolat

1. Validation of susceptibility testing with histogram analysis of consecutive clinical isolates

RAF-M rekommenderar att man i sin validering mäter och registrerar zondiametrar för ca 100 konsekutiva kliniska isolat för 10-15 vanligt förekommande art-/antibiotikakombinationer. De väljs så att de representerar resistensbestämningssystemet med avseende på inkubationstemperaturer, medier med och utan tillsatser och atmosfär. Bakom följande föreslagna kombinationer av art och antibiotikum redovisas många års resultat med ISA-medium och lappar från Oxoid Ltd. Texten inom parentes avser de olika medier (A-D, brytpunktstabeller) som rekommenderas för respektive art samt inkubationsmiljö och temperatur.

För MIC-bestämning jämför laboratoriet sina MIC-distributioner med de av RAF publicerade distributionerna (länk från antibiotikanamnen i MIC-brytpunktstabellerna).

To be able to use the zone diameter breakpoints recommended by the SRGA the laboratory has to verify that the method as used by the individual laboratory produces the intended quantitative result. This is done by comparing zone diameter distributions obtained in the laboratory with those used by the SRGA for breakpoint setting. By comparing 10 - 15 representative distributions the method should be calibrated and can be sustained by the use of reference strains for quality control. Below are a number of distributions obtained with ISA medium and antibiotic discs from Oxoid Ltd (text within parenthesis denotes medium A-D and incubation atmosphere and temperature - see MIC- and zonebreakpoint tables):

• Staphylococcus aureus - oxacillin 1 µg (B, luft, 30^oC)
• Staphylococcus aureus - klindamycin 15 µg (A, luft, 37^oC)
• Streptococcus pyogenes - oxacillin 1 µg (B, CO₂, 37^oC)
• Streptococcus pyogenes - erytromycin 15 µg (B, CO₂, 37^oC)
• Streptococcus pneumoniae - oxacillin 1 µg (B, CO₂, 37^oC)
• Streptococcus pneumoniae - erytromycin 15 µg (B, CO₂, 37^oC)
• Haemophilus influenzae - ampicillin 10 µg (C, CO₂, 37^oC)
• E.coli - trimetoprim 5 µg (A, luft, 37^oC)
• E.coli - nalidixinsyra 30 µg (A, luft, 37^oC)
• E.coli - nitrofurantoin 100 µg (A, luft, 37^oC)
• Pseudomonas aeruginosa - netilmicin 30 µg (A, luft, 37^oC)
• Pseudomonas aeruginosa - imipenem 10 µg (A, luft, 37^oC)
• Pseudomonas aeruginosa - ceftazidim 30 µg (A, luft, 37^oC)
• Campylobacter - erytromycin 15 µg (A, microaerofil, 37^oC)
• Campylobacter - ciprofloxacin 10 µg (A, microaerofil, 37^oC)

För de som använder ISA-medium och lappar från Oxoid finns fullständiga jämförelsehistogram "gömda" bakom antibiotikanamnen i zonbrytpunktstabellen.
För de som använder material från Biodisk gäller den ursprungliga "RAF-pärmens" histogramtablåer.

• Staphylococcus aureus - oxacillin 1 µg (B, air, 30^oC)
• Staphylococcus aureus - clindamycin 15 µg (A, air, 37^oC)
• Streptococcus pyogenes - oxacillin 1 µg (B, CO₂, 37^oC)
• Streptococcus pyogenes - erythromycin 15 µg (B, CO₂, 37^oC)
• Streptococcus pneumoniae - oxacillin 1 µg (B, CO₂, 37^oC)
• Streptococcus pneumoniae - erythromycin 15 µg (B, CO₂, 37^oC)
• Haemophilus influenzae - ampicillin 10 µg (C, CO₂, 37^oC)
• E.coli - trimethoprim 5 µg (A, air, 37^oC)
• E.coli - nalidixic acid 30 µg (A, air, 37^oC)
• E.coli - nitrofurantoin 100 µg (A, air, 37^oC)
• Pseudomonas aeruginosa - netilmicin 30 µg (A, air, 37^oC)
• Pseudomonas aeruginosa - imipenem 10 µg (A, air, 37^oC)
• Pseudomonas aeruginosa - ceftazidime 30 µg (A, air, 37^oC)
• Campylobacter - erythromycin 15 µg (A, microaerofilic, 37^oC)
• Campylobacter - ciprofloxacin 10 µg (A, microaerofilic, 37^oC)

For those using ISA medium and discs from Oxoid Ltd there are distributions for comparison "behind" the names of the antibiotics in the zone breakpoint table.

Om du upptäcker bristande överensstämmelse mellan laboratoriets histogram och RAF-M:s referenshistogram:

• Är förutsättningarna lika för referenshistogram och rutinhistogram? Lappstyrka? Tillsatser? Inkubationsmiljö (luft/CO2)? Inkubationstemperatur?
• Kan dålig överensstämmelse bero på brister/genvägar i art-diagnostik?
• Är tillräckligt många avläsare inblandade i laboratoriets histogram för att ge representativitet? Den vanligaste orsaken till bristande överensstämmelse är olikheter i inokulat. Dubbelpucklighet i huvudpopulationen förklaras oftast av att endast två personer svarar för histogrammet och att dessa har olika uppfattning om inokulatets täthet. 
• Drabbar avvikelserna i huvudsak media med tillsats(er) eller media eller lappar känsliga för lagring?
• Drabbar avvikelserna i huvudsak antibiotika vars aktivitet är pH-beroende (aminoglykosid, erytromycin)?
• Nitrofurantoin är känsligt för överautoklavering av mediet.

Om huvuddelen av histogrammen avviker bör det finnas ett mönster för avvikelserna!

• i huvudsak mindre zoner än referenshistogrammet: insådden för tät, agarvolymen i plattorna för stor, agarbatch-avvikelse. Se metoddelen av RAF-pärmen.
• i huvudsak större zoner än referenshistogrammet: Agarvolymen för liten, agarbatch-avvikelse.

Skicka gärna in en kopia av avvikande histogram till RAF-M (G. Kahlmeter, Klinisk mikrobiologi, Centrallasarettet, 351  85  Växjö eller till B. Olsson-Liljequist, SMI, 171 82 Solna) så att RAF-M hjälpa till med problemanalysen.

Should you discover that one or several of the histograms deviate from what is expected (the median is off, the distribution is wider than expected, that part of the distribution that ought to be unimodal is bimodal, etc) the pattern of the deviation can be used to diagnose the problem:

• are all basic parameters alike for the two histograms (disk strengths, additives, atmosphere, calibration of the CO₂-incubator, temperature etc). Are the species-diagnostic procedures equivalent?
• do the aberration(s) mainly occur with media containing supplements?
• or media or disks sensitive to storage? or antibiotics sensitive to changes in pH (aminoglycoside, erythromycin)?
• nitrofurantoin is sensitive to the degree of autoclaving of the medium.

If the majority of the histograms deviate from the expected there should be a pattern:

• inhibition zones smaller than the reference histograms: inoculum too dense or incorrect agar volume in the plates (depth >4 mm).
• inhibition zones larger than the reference histograms: incorrect agar volume in the plates (depth <4 mm).

Please send deviating histograms to Gunnar Kahlmeter (Clinical microbiology, Central Hospital, 351 85  Växjö, Sweden or Barbro Olsson-Liljequist (SMI, 171 82 Solna, Sweden).

2. Intern QC med referensstammar

Då valideringen utförts och godkänts övergår man till fortlöpande kvalitetskontroll.   Denna kan antingen utföras som (a) daglig (varje vardag) kontroll med referensstammar eller som (b) veckolig kontroll varvid man också måste utföra  kontroller i sb med tillverkningen av resistensplattor. Ju mer sällan kontrollerna utföres desto strängare krav på tillåten avvikelse för det enstaka värdet från rekommenderat intervall.

(a) Daglig kontroll med referensstammar utföres genom att 1 - 2 referensstammar inkluderas i det dagliga arbetet på 2 - 4 laboratoriesektioner (exempelvis S.aureus och E.faecalis på sårsekretavdelningen, S.pyogenes, S.pneumoniae och/eller H.influenzae på luftvägsodlingar, E.coli och P.aeruginosa på urinavdelningen). Den som alltid utför daglig kontroll med referensstammar behöver ej utföra andra kontroller men skall kunna härleda byten av batcher, procedurändringar etc så att avvikelser kan sättas i sb m ändringar i resistensbestämningssystemet.

(b) Veckolig kontroll med referensstammar utföres på samma sätt som daglig kontroll men 1 gång i veckan. Om metoden "veckolig kontroll med referensstammar" användes skall den substratkontroll som utföres i sb m tillverkning av resistansmedium kompletteras med kontroll med referensstammar (samma stammar och antibiotika som vid veckokontrollen). I samband med inskolning av ny personal, ny apparatur eller andra större ändringar ersättes veckokontrollen med daglig kontroll.

2. Internal QC with reference strains

When the AST system has been validated the subsequent quality control can be performed either as (a) daily checks with reference strains or as (b) weekly check with reference strains supplemented with batch control of every new batch of media

(a) Daily quality control with reference strains is performed by including 1 - 2 reference strains in the daily routine work in 2 - 4 of the routine sections of the laboratory (e.g. S.aureus and E.faecalis in the wound-section, S.pneumoniae and  H.influenzae (and/or S.pyogenes) in the respiratory tract section, and E.coli and P.aeruginosa in the urinary tract section). Note and date in the protocols all changes in the AST system (new batch of  medium, new batch of antibiotic discs, new procedures for media preparation, changes in production procedure or volumes, introduction of new apparatus, changes in water quality, etc).

(b) Weekly quality control with reference strains is performed as daily controls using the same reference strains. Weekly control must be supplemented with control of each new production batch of AST medium, whether inhouse or bought. The same reference strains and antibiotics as for the weekly control should be used. Weekly control is replaced by daily controls when changes in staffing occur or other procedural changes are isntituted.

Behandla alltid kvalitetskontrollerna som du behandlar rutinbestämningarna på den aktuella laboratorieavdelningen. Använd samma antibiotika och antal lappar per platta, samma inokulat, inkubationstid och läs av kvalitetskontrollerna tillsammans med rutinmässiga resistensbestämningar. Vanligen arbetar ni på dygnsfärska isolat i det kliniska arbetet - referensstammen skall då också vara dygnsfärsk. Enklast och mest utslagsgivande är att under kontrollperioden inkludera QC-stammarna bland de rutinmässigt utförda resistenserna.

Registrera resultatet av testerna på ett enkelt och överskådligt sätt och helst så att löpande medelvärden och standarddeviationer kan erhållas. I sin enklaste form kan ett millimeter-papper i A3-format ge utrymme för ett helt år och monteras det på ett bra underlag kan dagens zoner representeras av nålar med färgade huvuden.

Always treat QC-tests exactly as you would any routine isolate of that species in that section of the laboratory. Use the same antibiotics and number of discs/plate, the same inoculum preparation mode, make sure the reference strain and the clinical isolates are equally fresh at the time of testing, inoculate simultaneously and incubate together, etc.

Register the results in such away that the they can be immediately visualized together with the last 50 - 100 observations. A computer program will help but needles with multicoloured heads on a paper chart will do the job.

Slumpvariation kan inte undvikas men måste kontrolleras. De av RAF-M rekommenderade stammarna för kvalitetskontroll har i tabellerna givits riktvärden och ett intervall för acceptabel variation. Angivet intervall tillåter en fullt uppnåelig slumpvariation över tid. Slumpvis förekommande avvikelser utanför intervallet kan godkännas men inte trender eller återkommande mönster.
Analysen påverkas av frekvensen av kontrollerna.

• Om man valt att följa modellen med daglig kontroll accepteras två, men inte tre, på varandra följande avvikelser för ett antibiotikum innan analys/felsökning görs.
• Om man valt modellen med veckokontroll accepteras inte avvikelser. Redan första avvikelsen skall leda till analys/felsökning. Detsamma gäller kontroller av tillverkningsbatch.

Systematisk avvikelse (systematiskt för högt eller för lågt, eller en påvisad trend) skall korrigeras varvid man börjar med att avgöra om den skall tillskrivas resistensmediet  eller en annan del av systemet (inokulat, laboratoriepersonalen, lappstyrka, inkubationstid eller atmosfär). När vanliga tekniska orsaker till systematisk avvikelse uteslutits (batch, volymer, pH, lappstyrka, inkubationsförhållanden mm) är den vanligaste orsaken till systematisk avvikelse för tjockt inokulat.

Random errors cannot be avoided but shall be controlled. The recommended reference strains have been assigned target values and acceptable intervals for random variation. Randomly appearing deviations outside the interval can be accepted but trends and repeated patterns should be investigated, explained and corrected.
The analysis is affected by the frequency of the internal QC program:

• If daily controls are used, two but not three consecutive deviations can be accepted without further analysis.
• If a weekly control program is used, deviation from the norm is unacceptable. Any deviation should lead to an analysis and possibly repeated testing. The same holds for the batch production control. 

Systematic errors (systematic high or low values, or a trend) should be investigated and corrected. Exclude simple technical and easily corrected reasons for the deviation (disc content, volume of medium, pH of medium, atmosphere and incubation temperature). If this does not explain and solve the problem the most probable cause is the density of the inoculum.

Shewart diagram - E.coli ATCC 25922 - more than 600 consecutive QC measurements.

Kvalitetskontrollstammar. I RAF's metodbok presenteras i tabellform resultaten av upprepade MIC- och zondiameterbestämningar för särskilt utvalda referensstammar. Dessa har ATCC-, NCTC- och/eller CCUG-nummer. Tabellerna uppdateras regelbundet och vid behov adderas nya antibiotika. Förändringar från föregående revision markeras med fetstil. Andra användbara referensstammar och kontrollstammar med specifika resistensmekanismer finns listade i en särskild tabell.

Quality control strains. The SRGA QC-tables contain the results of repeated MIC- and disk diffusiontesting of the QC-strains (all are official ATCC-, NCTC- and/or CCUG-numbers). These strains can be obtained through the proper channels. 
The tables are regularly updated with new antibiotics and suggestions for additional reference strains. The following strains are recommended as "first-line" strains.

Escherichia coli ATCC 25922 (CCUG 17620)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (CCUG 17619)
Enterococcus faecalis ATCC 29212 (CCUG 9997)
Staphylococcus aureus ATCC 29213 (CCUG 15915)
Haemophilus influenzae NCTC 8468 (CCUG 23946)
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 (CCUG 33638)
Streptococcus pyogenes CCUG 25571 (CCUG 25571)
Bacteroides fragilis ATCC 25285  (CCUG 4856)

Links in parenthesis takes you to the original description of the type strains on the CCUG website

Förvaring av referensstammar

Referensstammar skickas vanligen till det beställande laboratoriet som ampull med frystorkat innehåll. När det beställande laboratoriet erhållit stammen bör laboratoriet göra en subkultur som förvaras i mindre portioner (rör med keramiska kulor/pärlor finns kommersiellt tillgängliga) i -70^o C för dagliga eller veckovisa kontroller. Ett rör eller en pärla i taget användes. Varje upptinad subkultur bör maximalt stickas om 2 gånger per vecka i högst 4 veckor eller för de som använder modellen med dagliga kontroller, dagligen i högst en vecka. Därefter måste man ta fram en ny nedfryst subkultur.

Storage of reference strains

Reference strains are usually delivered as freeze dried material in glass ampules. Perform a subculture on the freeze dried material and prepare a large number of vials for storage at -70^o C for daily and/or weekly use. Use one vial (or remove one pellet) at a time for subculture. Each subculture should be re-cultured no more than twice weekly for 4 weeks or daily for one week. After that a new subculture should be made from the frozen material.