Spädningsmetoder (RAF)

Dilution methods (SRGA)

Spädningsmetod i agar kan användas för att kvantitativt mäta in vitro aktiviteten av ett antibiotikum mot ett bakterieisolat. Metoden bygger på att bakterier testas mot stigande koncentrationer av antibiotikum i agar, och resultatet, uttryckt som minsta hämmande koncentration (MIC), avläses normalt efter inkubering i 20 timmar vid 37^o C. Resultatet är beroende av metodiken som därför måste standardiseras noga.

I detta avsnitt beskrives referensmetoder för tester i agar och buljong. Dessa har tidigare beskrivits i detalj i ICS-rapporten (Ericsson & Sherris, 1971). Spädningsmetoder ger ej nödvändigtvis samma resultat varje gång de utföres, även under strikt standardiserade förhållanden. Den allmänt accepterade reproducerbarheten hos metoderna är ± 1 spädningssteg av det "sanna" MIC-värdet. Eftersom endast vissa fasta koncentrationer och ej en kontinuerlig koncentrationsgradient används innebär detta att det sanna MIC-värdet ligger någonstans mellan det avlästa MIC-värdet och den närmast lägre koncentrationen. Om exempelvis 16 mg/l är det avlästa MIC-värdet bör det sanna MIC-värdet ligga mellan 16 och 8 mg/l.

Det är numera internationellt accepterat att använda tvåstegsspädningar av en utgångskoncentration (t.ex. 128 mg/l) som valts så att koncentrationen 1 mg/l alltid kommer att ingå i spädningsserien. Skillnad i resultat vid MIC-bestämning i fast eller flytande medium har oftast metodologiska förklaringar (se senare avsnitt).

The agar dilution method can be used for determining the in vitro activity of an antibiotic against a bacterial isolate. The bacterium is allowed to grow on a series of agar plates containing doubling dilutions of the antibiotic, and the result, defined as the minimum inhibitory concentration (MIC), is most often read after incubation at 35-37^o C for 20 hours. The result is highly dependent on the methodology and must therefore be carefully standardized.

In this chapter the two dilution methods are described , dilution in agar and in broth, and they are considered reference methods for susceptibility testing. The reader is also referred to the ICS-report (Ericsson & Sherris, 1971). Dilution methods do not necessarily give exactly the same result each time, despite strict standardization. The generally accepted methodological variation of both methods is + one dilution step of the "true" MIC value. Since a series of separate concentrations is used rather than a continuous gradient of concentrations, it means that the true MIC will fall in between the concentration inhibiting growth and the next lower concentration (e.g. the MIC is read at 16 mg/L but the true value is between 8 and 16 mg/L). It is generally accepted that the dilution series shall contain the concentration 1 mg/L. Differences in MICs are sometimes obtained between the two dilution methods but they often have methodological explainations.

Agarspädningsmetod för MIC-bestämning

Antibiotikasubstans

Referenssubstanser bör benämnas med sitt generiska namn för att undvika missförstånd. Referenssubstanser i pulverform kan erhållas från tillverkaren. Substansen bör vara märkt med det generiska namnet, mikrobiologisk aktivitet uttryckt som ug/mg substans och utgångsdatum. Uppgift om substansens löslighet erhålles från tillverkaren. Förvara substanser enligt tillverkarens rekommendationer, och om ej annat anges vid 4^o C i en exsickator under vacuum. Låt burk med substans uppnå rumstemperatur innan den öppnas för att undvika fuktbildning. Undvik att använda farmacevtiska beredningar avsedda för kliniskt bruk, eftersom dessa kan innehålla även andra ingredienser.

Beredning av stamlösningar och spädningar. Vid invägning av referenssubstans bör alltid analysvåg användas. Hänsyn måste tas till substansens mikrobiologiska aktivitet, så att den färdiga lösningen innehåller den önskade koncentrationen av aktiv substans. Följande formler är användbara för beräkning av invägd mängd respektive volym spädningsvätska:

• Vikt (mg) = önskad volym (ml) x önskad koncentration (µg/ml) / mikrobiologisk aktivitet (µg/mg)
• Volym (ml) = invägd mängd (mg) x mikrobiologisk aktivitet (µg/mg) / önskad koncentration (µg/ml)

De flesta substanser är lättlösliga i vatten. Vissa substanser kräver speciella lösningsmedel. Minsta möjliga mängd av lösningsmedlet användes, och därefter tillsättes sterilt vatten eller fosfatbuffert till önskad volym. Stamlösningar som dispenserats i små plaströr av polypropylen eller polyeten, kan i de flesta fall förvaras vid -70^o C upp till 6 månader utan att aktiviteten minskar. Frusen stamlösning tas fram samma dag som den skall användas och eventuellt överbliven lösning kastas.

Grundmedium

Ett lämpligt medium skall tillåta god växt av de flesta patogena bakterier, uppvisa liten variation mellan olika tillverkningssatser för att garantera god reproducerbarhet, samt ha låga koncentrationer av eventuella inhibitorer (ex tymidin eller tymin vid bestämning av trimetoprim). Halten av divalenta katjoner måste vara standardiserad eftersom den kan påverka resultaten, särskilt vid test av aminoglykosider mot P.aeruginosa. Det ska ha god buffertkapacitet och därmed uppvisa stabila pH under inkubation och mellan tillverkningsbatcher. Det ska kunna supplementeras med olika tillväxtfaktorer, blod, blodprodukter mm. Flera medier finns tillgängliga, t.ex Mueller Hinton (många fabrikat), Iso-Sensitest agar (Oxoid Ltd).

RAF-M rekommenderar för närvarande enbart Iso-Sensitest (Oxoid Ltd).

Beredning av plattor

Antibiotikalösningar i lämpliga koncentrationer sätts till autoklaverad agar som fått svalna till 48-50^o C. Oftast användes 1 del antibiotikalösning (10 x önskad slutkoncentration) till 9 delar agar. Blanda noga och gjut agarn snabbt i petriskålar på plant underlag. Färdiggjutna plattor användes genast eller förvaras i sluten plastförpackning vid 4^o C och användes inom 1 vecka. Särskilt känsliga för inaktivering är betalaktamantibiotika och tetracykliner. Hållbarheten hos antibiotikainnehållande plattor kontrolleras genom användande av referensstammar med kända MIC-värden. Plattor utan antibiotikum gjutes parallellt och användes som kontrollplattor för bakterietillväxt och renhet.

Beredning av inokulat

Se Diskdiffusion

Inokulering och inkubering av plattor

Agarytan måste vara helt torr före inokulering, men onödigt lång torktid i termostat bör unvikas. Markera inokulatets placering på agarplattorna. Applicera 1-2 µl av varje inokulat på agarytan (motsvarar ca 10³ cfu/droppe) förslagsvis med hjälp av replikator. Börja med att inokulera en kontrollplatta utan antibiotikum, därefter plattor med antibiotikum i stigande koncentrationer, och sist en ny kontrollplatta. Låt inokulaten torka vid rumstemperatur och inkubera sedan plattorna vid 37^o C under 16-20 timmar. Om längre inkuberingstid krävs för att isolatet skall växa fram jämförs resultatet med det av en parallellt testad referensstam som inkuberats lika länge. Vid resistensbestämning mot isoxazolylpenicillin inkuberas plattor vid 30^o C. För vissa bakteriearter krävs inkubering i 37^o C med 5% CO₂ eller annan miljö.

Avläsning av MIC

Placera plattorna på en mörk, icke reflekterande bakgrund. Avläs MIC-värdet som den lägsta koncentration av antibiotikum som fullständigt hämmar bakterieväxt. Växt av en enstaka koloni eller en tunn hinna på applikationsstället ignoreras. Om ett litet antal kolonier växer vid koncentrationer flera gånger högre än den som hämmar majoriteten bör isolatet undersökas på nytt. Sådana kolonier kan vara uttryck för kontamination, resistenta mutanter, betalaktamasproducerande organismer eller, om inkubationen är förlängd, återväxt av känsliga bakterier på grund av inaktivering av antibiotikum i agarplattan.

Agar dilution MIC

Antibiotic substances

Stock solutions and dilutions. Always use an analytical balance when preparing stock solutions from the reference compounds. Compensate for the microbiological activity if it is < 100% by using one of the following

• Volume (mL) = obtained weight (mg) x microbiological activity (µg/mg) / desired concentration (µg/mL)
• Volume (mL) = obtained weight (mg) x microbiological activity (µg/mg) / desired concentration (µg/mL)

Most compounds are soluble in water, but some require special procedures. Use a minimal amount of the recommended solvent and make further dilutions with water. Stock solutions of most compounds can be kept in small plastic tubes (polypropylene or polyethene) at –70^o C for 6 months without any loss of antimicrobial activity. Frozen stock solutions are thawed on the day of use. Discard of any leftovers, they should not be refrozen.

Basic medium

A good medium should allow abundant growth of most bacterial pathogens, show little variation between batches to guarantee a high degree of reproducibility, and it should contain only small amounts of inhibitory compounds (e.g. thymidine or thymine which will affect the result when testing trimethoprim). The amount of divalent cations should be standardized since it will effect the activity of aminoglycosides, especially against P.aeruginosa. The medium should have a high buffer capacity. It should allow for supplementation with growth enhancing factors like blood and blood products when testing fastidious bacteria like Haemophilus and pneumococci. There are several products available for susceptibility testing of bacteria, Mueller Hinton (several producers) and Iso-Sensitest agar (Oxoid Ltd).

The SRGA recommends for the time being Iso-Sensitest (Oxoid Ltd).

Solutions of antibiotics are mixed with which has been autoclaved and allowed to cool down to 48-50^o C. It is practical to use one part of antibiotic solution (being 10 times the desired final concentration) and nine parts of molten agar. Mix carefully and pour the agar plates immediately on a level surface. Use the plates the same day or keep them wrapped in plastic in the cold room for not more than a week. It is not advisable to keep plates containing betalactam antibiotics or tetracyclines for more than one day, since their antibacterial activity will rapidly decline. Plates are preferably controlled by using using reference strains with known MICs. Do not forget to prepare plates without antibiotics to be used for control of growth and sterility of the medium.

Preparation of inoculum

See chapter on "Disk diffusion"

Inoculation and incubation of plates.

The surface of the agar plates must be completely dry before inoculation. Mark the plates for orientation. Apply the bacterial inocula in 1-2 µL amounts by means of an inoculating device (replicator). Start inoculating a plate without antibiotic (growth control), and continue with the plate containing the lowest concentration of antibiotic and then those with higher concentrations. A second control plate can be inoculated at the end. Leave the plates to dry in room temperature before incubating them at desired atmosphere and temperature. Always include one or several reference strains with each test, so that they will be treated exactly the same way as the test strains.

Reading the MIC

Place the plates on a dark, non-reflecting background. Read the MIC as the lowest concentration which completely inhibits bacterial growth. Growth of a single colony or a barely visible haze on the spot of inoculation should be ignored. If a small number of colonies appear on several plates with concentrations higher than the one inhibiting the main part of the inoculum, then this isolate should be retested. These colonies could represent a contamination, but could also be resistant mutants (e.g. betalactamase high producers).

2. Buljongspädning för MIC-bestämning

2. Broth dilution for MIC-determination

Antibiotikasubstans

Referenssubstanser bör benämnas med sitt generiska namn för att undvika missförstånd. Referenssubstanser i pulverform kan erhållas från tillverkaren. Substansen bör vara märkt med det generiska namnet, mikrobiologisk aktivitet uttryckt som ug/mg substans och utgångsdatum. Uppgift om substansens löslighet erhålles från tillverkaren. Förvara substanser enligt tillverkarens rekommendationer, och om ej annat anges vid 4^o C i en exsickator under vacuum. Låt burk med substans uppnå rumstemperatur innan den öppnas för att undvika fuktbildning. Undvik att använda farmacevtiska beredningar avsedda för kliniskt bruk, eftersom dessa kan innehålla även andra ingredienser.

Beredning av stamlösningar och spädningar. Vid invägning av referenssubstans bör alltid analysvåg användas. Hänsyn måste tas till substansens mikrobiologiska aktivitet, så att den färdiga lösningen innehåller den önskade koncentrationen av aktiv substans. Följande formler är användbara för beräkning av invägd mängd respektive volym spädningsvätska:

• Vikt (mg) = önskad volym (ml) x önskad koncentration (µg/ml) / mikrobiologisk aktivitet (µg/mg)
• Volym (ml) = invägd mängd (mg) x mikrobiologisk aktivitet (µg/mg) / önskad koncentration (µg/ml)

De flesta substanser är lättlösliga i vatten. Vissa substanser kräver speciella lösningsmedel. Minsta möjliga mängd av lösningsmedlet användes, och därefter tillsättes sterilt vatten eller fosfatbuffert till önskad volym. Stamlösningar som dispenserats i små plaströr av polypropylen eller polyeten, kan i de flesta fall förvaras vid -70^o C upp till 6 månader utan att aktiviteten minskar. Frusen stamlösning tas fram samma dag som den skall användas och eventuellt överbliven lösning kastas.

Val av medium

Buljong avsedd för känslighetsbestämning av bakterier mot antibiotika, och som ger god växt av snabbväxande bakterier, t.ex. Iso-Sensitest eller Mueller Hinton, kan användas. Buljongen måste visa god reproducerbarhet mellan tillverkningssatser samt ge överensstämmande resultat med motsvarande agar. Det är viktigt att halten av divalenta katjoner är noga kontrollerad eftersom den kan påverka resultaten, särskilt med aminoglykosider mot Pseudomonas aeruginosa. Vissa särskilt näringskrävande bakterier behöver extra tillsatser för att kunna växa, t.ex Haemophilus species och vissa streptokocker. Vid resistensbestämning mot isoxazolylpenicilliner skall NaCl tillsättas buljongen. Tillverkarens rekommendationer för beredning av buljongen följes, och pH vid rumstemperatur i den färdiga buljongen bör vara 7.2-7.4.

Beredning av spädningsrör

Stamlösning av antibiotikum spädes i buljong till koncentrationer som är två gånger högre än önskade slutkoncentrationer. Vid arbete i "makro"-skala är slutvolymen vanligen 1 ml/rör (0.5 ml buljong med antibiotikum + 0.5 ml bakteriekultur), och i "mikro"-skala 50-100 µl/brunn (mikrotiterbricka). Om kommersiellt tillgängliga antibiotikainnehållande mikrotiterplattor användes följs tillverkarens instruktioner. Beredda spädningar i rör eller brickor kan frysas vid -70^o C och förvaras upp till 6 månader. Antibiotikahalten i spädningarna kontrolleras genom användande av referensstammar med kända MIC-värden. Spädningar framtagna ur frysen får ej frysas igen utan överblivna rör eller brickor kastas.

Beredning av inokulat

Doppa en ögla i 5-10 kolonier och slamma i 1 ml PBS-buffert. Denna suspension bör motsvara tätheten McFarland 0.5. Därav tages 50 µl till 5 ml buljong (ca 10⁶ cfu/ml; bakterieräkning). Denna suspension användes inom en halvtimme för att inokulera buljongrör (0.5 ml/rör) eller mikrotiterplattor (50 µl/brunn) med antibiotikaspädningar. Detta resulterar i en 1/2 spädning av varje koncentration och en 1/2 spädning av bakterieinokulatet.

Inkubering

Inokulerade rör eller brickor inkuberas i lämplig miljö vid 37^o C i 16-20 timmar. Om längre inkuberingstid krävs för att erhålla synlig bakterieväxt jämförs resultatet med det av en parallellt testad referensstam som inkuberats lika länge. Vid test av isoxazolylpenicillin inkuberas rör eller brickor vid 30^o C i 24 timmar. Mikrotiterbrickor förslutes med tejp för att förhindra avdunstning under inkubationen.

Avläsning av resultat

Före avläsning skakas rören (ej för kraftigt) eftersom vissa bakterier kan ha sedimenterat. MIC är den lägsta koncentration av ett antibiotikum som fullständigt hämmar synlig bakterieväxt. Eventuell växt i spädningsrören registreras lättast mot en mörk bakgrund. Växt i mikrotiterbrunnar ses som en grumling eller för vissa bakteriearter som "knappar" i botten av brunnen och avläses lättast från botten med hjälp av en specialgjord spegel.

Antibiotic substances

Antibiotic (reference) compounds should be referred to by their generic names. They are normally obtained from their respective producers, who also should provide all necessary information about their products (microbiological activity in ug/mg, expiry date, solubility etc.). Store the compounds according to instructions from the producer, and if nothing else is stated they should preferably be kept in a dry place under vacuum at 4^o C. Let the antibiotic vial reach room temperature before opening it to avoid moisture. Do not use pharmaceutical products intended for clinical use, since these might contain other ingredients as well.

Stock solutions

Always use an analytical balance when preparing stock solutions from the reference compounds. Compensate for the microbiological activity if it is < 100% by using one of the following:

• Weight (mg) = desired volume (mL) x desired concentration (µg/ml) / microbiological activitity (µg/mg)
• Volume (mL) = obtained weight (mg) x microbiological activity (µg/mg) / desired concentration (µg/mL)

Most compounds are soluble in water, but some require special procedures. Use a minimal amount of the recommended solvent and make further dilutions with water. Stock solutions of most compounds can be kept in small plastic tubes (polypropylene or polyethene) at –70^o C for 6 months without any loss of antimicrobial activity. Frozen stock solutions are thawed on the day of use. Discard any leftovers, they should not be refrozen.

Choice of medium

Broth intended for susceptibility testing of bacteria should allow abundant growth of most bacterial pathogens, show little variation between batches to guarantee a high degree of reproducibility, and it should contain only small amounts of inhibitory compounds (e.g. thymidine or thymine which will affect the result when testing trimethoprim). The amount of divalent cations should be standardized since it will effect the activity of aminoglycosides, especially against P.aeruginosa. The medium should have a high buffer capacity. It should allow for supplementation with growth enhancing factors when testing fastidious bacteria like Haemophilus and pneumococci. There are several products available for susceptibility testing of bacteria, e.g. Mueller Hinton broth (several producers) and Iso-Sensitest broth (Oxoid Ltd). Prepare the broth according to the instructions by the manufacturer.

Preparation of antibiotic dilutions

From the antibiotic stock solution a series of dilutions are prepared in broth to yield concentrations twice the desired final concentrations. In a macrobroth dilution test the final volume in each test tube is usually 1 mL (0.5 mL of antibiotic dilution in broth and 0.5 mL of bacterial inoculum in broth). In microbroth dilution tests the final volume in each test vial is 50-100 µl (microtiter trays). If commercially available trays are used preparations should be made according to the manufacturer´s recommendations. The series of antibiotic dilutions are preferably controlled by reference strains with known MICs.

Preparation of inoculum

Suspend a loopful of bacteria (from 5-10 colonies) in 1 mL of PBS or saline, yielding a suspension corresponding to the turbidity of McFarland 0.5. Take 50 µl to 5 mL broth (approx. 10⁶ cfu/mL; check by viable count). Use this suspension within 30 min to inoculate tubes (0.5 mL/tube) or microtiter trays (50 µL/vial) already containing the antibiotic dilutions in broth, resulting in a1/2 dilution of each concentration and of the bacterial inoculum.

Incubation

Incubate the inoculated tubes or trays at 35-37^o C for 16-20 h (or longer if necessary) in the recommended atmosphere for the bacterial species to be tested. As control, always include a reference strain with known MIC in parallel with the test strain.

Microtiter trays should be sealed during incubation to protect from evaporation

Reading MICs

Shake the tubes gently before reading. It is recommended to judge the turbidity in the tubes against a dark background (microtiter trays can be read using special devices or automatically in photometers). The MIC is read as the lowest concentration yielding no visible growth.

3. MBC bestämning

MBC definieras som den lägsta koncentration av ett antibiotikum som avdödar majoriteten av en bakteriepopulation (oftast 99.9%, dvs en tusenfaldig minskning av växt) efter inkubation under en bestämd tid. Resultat av MBC-bestämning är metodberoende. Testen måste därför vara strikt standardiserad för att ge reproducerbara resultat. Det bör observeras att bakteriostatiska medel med låga MIC-värden definitionsmässigt ger flerfaldigt högre MBC-värden.
Resultat av MBC-bestämning kan användas som vägledning vid antibiotikabehandling av allvarliga infektioner, t ex endokardit, där baktericid aktivitet av antibiotikum anses väsentlig.

Utförande. Metodiken är en utvidgning av MIC-bestämning med buljong-spädningsmetod. Efter avläsning av MIC-värdet sprids en känd volym (vanligen 50-100 µl) från sista röret eller brunnen med synlig växt och från följande rör eller brunnar utan synlig växt till antibiotikafria agarplattor. För att undvika "carry-over" effekt, dvs att antibiotikum som finns i buljongen påverkar resultaten, är det viktigt att låta droppen ligga 1-2 minuter innan spridning sker över agarytan (hel platta eller del av platta). Efter inkubering 18-20 timmar räknas antalet kolonier vilket jämförs med det ursprungliga inokulatets storlek.
Exempel: Om ursprungsinokulatet innehåller 2x10⁶ cfu/ml erhålls vid MIC-bestämning spädning 1/2 (0.5 ml buljong med antibiotiotikum + 0.5 ml bakteriekultur), dvs 10⁶ cfu/ml. En tusenfaldig minskning i växt motsvarar då 10³ cfu/ml. Vid spridning av 0.1 ml innebär detta en "spädning" 1/10, varför 10² cfu kan tillåtas växa. Den lägsta koncentrationen av antibiotikum som tillåter växt av <100 cfu utgör därför definitionsmässigt MBC.

3. MBC determination

The minimum bactericidal concentration (MBC) is defined as the lowest concentration of an antibiotic killing the majority of a bacterial inoculum (99.9%, equivalent to a thousand-fold reduction of the inoculum). The MBC obtained is highly dependent on methodological factors, and so the test must be strictly standardized regarding both materials and techniques to give reproducible results.

It should be noted that antibiotics considered as bacteriostatic by definition yield low MICs but high MBC values. Determining the MBC is sometimes useful for control of antibiotic therapy in serious infections where bactericidal activity is especially important (e.g. endocarditis).

Method. Following a broth dilution MIC test, from each tube in the dilution series a defined volume (often 25-50 µL) is spread onto plates without antibiotics. To minimize the carry-over effect of antibiotic from the test tubes, let the drop "dry" before the inoculum is spread over the surface (a section of the agar plate). Incubate the plate overnight (longer for slow growing bacteria) and then count the number of colonies growing from each of the test tubes. The number of colonies corresponding to a thousand-fold reduction (MBC) can be calculated if the colony count of the start inoculum is known.

RAF och RAF-M
Uppdaterat 2005-02-07 (bara stavning), G Kahlmeter

SRGA and SRGA-M,
Revised 2005-02-07 (only spelling), G Kahlmeter