Antibiotika resistensbestämning av Neisseria gonorrhoeae (gonokocker).

Antimicrobial susceptibility testing of Neisseria gonorrhoeae (gonococci).

Inledning

Resistensbestämning av gonokocker erbjuder särskilda problem i val av medier, standardisering, metodkontroll och tolkning av resultat.

RAF rekommenderar att endast laboratorier med särskilt intresse för Neisseria gonorrhoeae utför resistensbestämning. Laboratorier med få isolat utför en screentest för kinolonresistens (nalidixinsyra-lapp 30 µg) och skickar i övrigt isolatet till Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Universitetssjukhuset Örebro för typning och resistensbestämning.  

1994 utgavs "Infektionsdiagnostik. I.6. Sexuellt överförbara infektioner (STD)". Texten nedan (senast reviderad maj 2006) är en omarbetad och uppdaterad version av referensmetodiken som beskrivs i denna utgåva. 

Introduction

Susceptibility testing of Neisseria gonorrhoeae poses special problems in the choice of media, methods, standardization, and interpretations of results.

The Swedish Reference Group for Antibiotics (SRGA) recommends that only laboratories with a special interest in Neisseria gonorrhoeae perform complete antimicrobial susceptibility testing. Laboratories with few isolates should perform a screen test for quinolone resistance (nalidixic acid 30 µg disc) and send the isolates to the National Reference Laboratory for Pathogenic Neisseria, Örebro University Hospital for confirmation, typing and susceptibility testing.

Aktuell resistens för N. gonorrhoeae isolerade i Sverige visas i separat tabell!

Antimicrobial resistance in N. gonorrhoeae isolated in Sweden is shown in a separate table. 

Rekommendationer för resistensbestämning (enligt RAF och Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria)

Metoder

Referenssubstrat. Som referenssubstrat rekommenderas GC Medium Base agar (BD) med 1 % hemoglobin och 1 % IsoVitaleX.

Agarspädning referensmetod. Agarspädningsmetod för bestämmande av minsta hämmande koncentration är referensmetod och bas för MIC-bestämningen. Mätosäkerheten är som för alla spädningsmetoderna genomförda enligt referensmetodiken ±1 MIC-steg. Metoden anses mindre väl lämpad som rutinmetod för resistensbestämning av gonokocker. Med agarspädning som referensmetod kan framförallt Etest men även standardiserad diskdiffusion användas som rutinmetod för resistensbestämning av gonokocker.

Etest som rutinmetod. Med Etest anges mätvärdet i mg/L och SIR-klassifikationen utförs med angivna brytpunkter i MIC-gränser från RAF, Tabell 1 och 2. Mätosäkerheten med Etest är ±1 MIC-steg (dvs. ±2 skal-streck på Etest-remsan).

Betalaktamastest. Slamma gonokocker, 5x10⁹/mL, i 0,3 ml avjoniserat sterilt vatten. Nitrocefindisk läggs i lösningen. Avläsning efter 10 min. Omslag till rött = positiv, gul färg = negativ.
Gonokockerna kan tas från valfritt agarmedium.

Recommendations for antimicrobial susceptibility testing (according to RAF and Swedish Reference Laboratory for Pathogenic Neisseria)

Methods

Reference substrate. GC Medium Base (BD) agar with 1% hemoglobin and 1% IsoVitalex.

Agar dilution method. The agar dilution method is the reference method for determining MIC-values. The reproducibility is ±1 dilution step. The agar dilution method is less suited for routine susceptibility testing but is needed to calibrate the Etest or disk diffusion.

Etest for routine susceptibility testing. The Etest gives values in mg/L. The reproducibility is ±1 dilution step (i.e. ±2 MIC-values according to the Etest strip). The results are classified as S, I or R with the MIC-breakpoints given in the MIC-breakpoint table 1 and 2 from SRGA.

Beta-lactamase test. The bacteria (5x10⁹/ml) are suspended in 0.3 mL deionized sterile water. A nitrocephin disc is placed in the solution. The test is read after 10 minutes as negative if yellow and positive if red.

Diskdiffusion som rutinmetod. Diskdiffusionsmetodens tidigare låga reproducerbarhet vid resistensbestämning av gonokocker kan till stor del tillskrivas brist på standardisering och kvalitetskontroll av metoden. Resultatet av diskdiffusionsmetoden kan inte anges i MIC-värden utan endast som SIR-grupp. För att ange osäkerhet i SIR-grupperingen analogt med agarspädning och Etest bör en gräns sättas kring brytpunkterna med 3 mm på var sida (motsvarande ca ±1 (ett helt) MIC-steg). Om mätvärdet faller inom denna zon anges osäkerheten i SIR-grupperingen. Under perioder med lågt antal gonokockisolat är det enklare och säkrare att använda en standardiserad Etest metod.

Disk diffusion for routine susceptibility testing. Disk diffusion can be performed but requires pronounced standardization. Historically the disk diffusion method in susceptibility testing of N. gonorrhoeae has been fraught with poor reproducibility. During times with few isolates it is easier and safer to use a standardized Etest methodology.

Intern kvalitetssäkring. Om ett relativt lågt antal gonokockisolat analyseras årligen på laboratoriet bör en intern kvalitetssäkring av resistensbestämningen ske i samband med varje klinisk resistensbestämning av N. gonorrhoeae. I annat fall kan en kvalitetssäkring utföras regelbundet (en gång per vecka eller månad beroende av antalet analyser) och vid ”batch”-byte av basagar. Lämpliga referensstammar beskrivs i tabellen nedan.

Internal quality control. If relatively few isolates are analysed annually at the laboratory, an internal quality control of antimicrobial susceptibility testing should be performed whenever a routine AST is performed. If many isolates are analysed, an internal quality control can be performed once a week or once a month (dependent on the number of isolates) and when the batch of the base agar is changed. Suitable reference strains are described in the table below1. 

Antibiotika som ingår i rutinmässig resistensbestämningen av Neisseria gonorrhoeae (Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria).

Ampicillin analyseras som representant för beta-laktamas instabila penicilliner. Azitromycin utgör representant för makrolider. Cefixim och ceftriaxon representerar beta-laktamas stabila cefalosporiner. Ciprofloxacin är den kinolon som oftast använts i Sverige för gonorrébehandling.
Spectinomycin, ceftriaxon, cefotaxim, cefixim eller i vissa fall azitromycin är alternativ vid behandling av multiresistenta gonokocker. Samtliga gonokockisolat analyseras även med diskdiffusionsmetod för känslighet mot nalidixinsyra (30 mg) på medium med defibrinerat hästblod och NAD (NAD-medium; medium B i RAF:s tabeller) (se den nya svenska modellen för resistensbestämning).
Denna fullständiga resistensbestämning inklusive test för beta-laktamas produktion utföres på referenslaboratoriet för samtliga N. gonorrhoeae isolat. Detta motiveras bl a av att det nationellt och internationellt hela tiden sker en ökning av andelen stammar med nedsatt känslighet eller resistens mot ett eller flera traditionella antibiotika. 

Antibiotics in the routine susceptibility testing of Neisseria gonorrhoeae (National Reference Laboratory for Pathogenic Neisseria).

Every isolate of N. gonorrhoeae is tested against ampicillin (representing beta-lactamase instable penicillins), cefixime and ceftriaxone (representing beta-lactamase stable cefalosporins), ciprofloxacin (representing quinolones), azithromycin (representing macrolides), and spectinomycin.
Spectinomycin, ceftriaxone, cefotaxime, cefixime and in some cases azithromycin are alternatives against multiple resistant gonococci.

Tolkning

Definition av känslighetsgrupperna S, I och R. Det har visat sig svårt att anpassa gränsvärden för vissa antibiotika till känslighetsgrupper för resistensbestämning av gonokocker till SIR-systemet. Höggradig plasmidmedierad resistens mot penicilliner (beta-laktamasproducerande stammar) identifieras utan problem. Vid kromosomal resistens däremot föreligger i många fall stegvis resistensutveckling. Detta medför att isolaten inte är indelade i en känslig och en resistent population och att SIR-tolkningen inte alltid kan göras med god reproducerbarhet. Många isolat har MIC på gränsen mellan känslighetsgrupperna varför S/I och I/R lätt kan komma att ändras vid upprepade resistensbestämningar av samma stam.

Traditionell behandling av okomplicerad genital gonorré sker som en- eller tvådosbehandling med krav på utläkning i >95 % av behandlade fall där isolatet bedöms som känsligt för medlet ifråga. Känslighetsgrupperna S, I och R betyder således inte detsamma för gonokockerna som vid resistensbestämning av övriga bakterier. Definitionen av R är också annorlunda än för övriga bakterier: R betyder att sannolikheten för att uppnå utläkning är mindre än 90 %. Denna indelning av känslighetsgrupperna är i enlighet med rekommendationerna från WHO Collaborating Centre, Statens serum institut (SSI), Köpenhamn, Danmark.

·         känslig (S)    >95 % behandlingseffekt med rekommenderad dos vid behandling av okomplicerad genital gonorré.

·         indeterminant (I) 90-95 % effekt med rekommenderad dos vid behandling av okomplicerad genital gonorré, eller >95 % effekt vid ökad dosering.

·         resistent (R) <90 % effekt av rekommenderad dos vid behandling av okomplicerad genital gonorré.

Observera således att ovanstående SIR-indelning och nedan angivna gränsvärden avser okomplicerad gonorré.

Gränsvärden för indelning av Neisseria gonorrhoeae vid okomplicerad genital gonorré i känslighetsgrupperna S, I och R.
MIC-gränser från RAF (Tabell 1 och 2) visar gränsvärden för indelning i känslighetsgrupperna S, I och R. Till grund för flera av de äldre gränsvärdena ligger kravet att serumkoncentrationen bör ligga över MIC under några timmar, t ex minst 5 gånger högre än MIC 8 timmar efter doseringen, för att effekten skall vara säker. Gränsen för bensylpenicillin och ampicillin förutsätter att patienten samtidigt får probenecid för att fördröja utsöndringen och uppnå högre koncentration.
Gränsvärdena för ciprofloxacin, cefixim, ceftriaxon, cefotaxim och azitromycin är emellertid fastlagda som artrelaterade gränser baserat på MIC-distributioner vilket innebär att isolat som besvaras S kan förutsättas helt sakna resistensmekanismer mot medlet ifråga. Det gäller också isolat med tydlig inhibitionszon runt nalidixinsyra-lappen (30 µg). 

Interpretation

S, I and R in uncomplicated genital gonorrhoeae. Neisseria gonorrhoeae do not for all antimicrobials present themselves in proper uni- or bimodal MIC- or zone diameter distributions. The lack of a natural host beside man has corrupted the wild type gonococci to a degree where "normal" or "wild type" populations are hard to identify for many antibiotics. This affects the reproducibility of results since there are few natural places to divide one part of the population from another. This affects both disk diffusion and MIC-testing irrespective of technique.

Traditional therapy of uncomplicated genital gonorrhoea consists of one or two doses of antibiotics with the expectance of a >95% cure if the isolate is considered susceptible to the antibiotic in question. The definition of "R" is also different for gonococci than the standard SRGA-definition - the probability of cure is less than 90%. This classification is in accordance with the recommendations of the WHO Collaborating Centre, Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark.

·         susceptible (S)   >95% cure attained with recommended dose in the treatment of uncomplicated genital gonorrhoea.

·         indeterminant (I) 90-95% cure attained with recommended dose in the treatment of uncomplicated genital gonorrhoea or >95% cure if the dose is increased.

·         resistant (R) <90% cure attained with recommended dose in the treatment of uncomplicated genital gonorrhoea.

Observe that the SIR-definitions and the MIC-breakpoints are for uncomplicated genital gonorrhoea.

MIC-breakpoint from SRGA (Table 1 and 2) show breakpoints for S-, I- and R-classification of Neisseria gonorrhoeae in uncomplicated genital gonorrhoea. The breakpoints are based on the assumption that the serum concentration of the antibiotic should supersede the MIC during a defined period of time. The breakpoints for benzylpenicillin and ampicillin are only valid if the patient receives concomitant probenicid to prolong the penicillin excretion.
The breakpoints for ciprofloxacin, cefixime, ceftriaxone, cefotaxime, and azithromycin are, however, epidemiological cut off values based on species specific MIC-distributions. Strains classified as susceptible to these antibiotics (including those with a prominent inhibition zone to nalidixic acid 30 µg) can be considered devoid of resistance mechanisms.

Referensstammar för resistensbestämning

Nationella referenslaboratoriet i Örebro använder och rekommenderar nu följande gonokockstammar för bedömning av kvaliteten på resistensbestämningarna:

SSI 130/92 (CCUG 41810) (tetracyklin-resistent)
SSI 91-25 (CCUG 41811) (spectinomycin-resistent)
SSI 91-51 (CCUG 41812) (resistent ,mot benzylpenicillin, ampicillin och cefuroxim. Negativ för beta-laktamas)
SSI 40-1996 (CCUG 41813) (ciprofloxacin-resistent; beta-laktamas positiv).

Referensstammarna kan erhållas från Culture Collection of the University of Gothenburg (CCUG).

Accepterade gränser för referensstammarna då de utnyttjas för kontroll av resistensbestämningarna med Etest framgår av tabellen nedan 1.

Reference strains for susceptibility testing

The Swedish Neisseria reference laboratory in Örebro recommends that the following gonococcal reference strains are used in the quality control of susceptibility testing. The target MIC-values and acceptable variation are shown in the Table below.

SSI 130/92 (CCUG 41810) (tetracycline resistant)
SSI 91-25 (CCUG 41811) (spectinomycin resistant)
SSI 91-51 (CCUG 41812) (resistant to benzylpenicillin, ampicillin and cefuroxime. Negative for beta-lactamase)
SSI 40-1996 (CCUG 41813) (ciprofloxacin resistant; beta-lactamase positive)

The reference strains can be obtained from the Culture Collection of the University of Gothenburg (CCUG).

Tabell. Accepterade MIC-värden (mg/L) vid resistensbestämning av referensstammar.
Table. Accepted MIC-values (mg/L) of reference strains

Referenssubstrat för resistensbestämning av Neisseria gonorrhoeae

GC resplattor enl RAF (1 L)

Deklaration:

A.     GC Medium Base (BD) agar - 36 g

B.     RO-vatten - 600 mL

C.     Hemoglobin Powder - 10 g

D.     RO-vatten - 400 mL

E.      IsoVitaleX Enrichment - 10 mL

Beredning: Blanda C och D (hemoglobin och RO-vatten) i en kolv. Rör om med omrörare 30 min. Blanda A och B (GC Medium Base agar och RO-vatten) i en kolv. Autoklavera kolvarna:
Autoklavparametrar: TEMP 121° och tid 15 min
Beredning av tillsatser: Gör iordning E enl anvisningar på förpackningen. När agarn ska gjutas (låt svalna till ca 50° C i vattenbad), häll C-D i A-B samt blanda i E. OBS! Använd tratt och sil som finns sterilförpackade.
pH-värde: 7,0 - 7,4
Dispensering: 60 mL i 14 cm petriskål eller 25 mL i 9 cm petriskål så att ett 4 mm djupt agarskikt erhålles.
Förvaring: I plastpåse. Hållbarhet i plastpåse 8 veckor.

Reference substrate for susceptibility testing of Neisseria gonorrhoeae

GC plates SRGA-recommendation (1 L)

Declaration:

A.     GC Medium Base (BD) agar - 36 g

B.     Sterile water (RO-quality) - 600 mL

C.     Hemoglobin Powder - 10 g

D.     Sterile water (RO-quality) - 400 mL

E.      IsoVitaleX Enrichment - 10 mL

Preparation: Mix C and D (hemoglobin and water) and stir for 30 minutes. Mix A and B (GC Medium Base agar and water) in a separate flask.
Autoclave both mixtures (temperature 121° for 15 min).
Prepare E (IsoVitaleX) in accordance with the package insert.
Mix C-D in A-B and add E.
pH: 7.0 - 7.4
Dispense: 60 mL in 14 cm petri dishes or 25 mL in 9 cm petri dishes to produce a 4 mm deep agar layer.
Store: in a sealed plastic bag for a maximum 8 weeks.