N.gonorrhoeae

Inledning

Resistensbestämning av gonokocker erbjuder särskilda problem i val av medier (särskilt substrat, GCRAP, som inte används i andra sammanhang), metoder, standardisering, tolkning av resultat och kvalitetssäkring. Dessutom är Neisseria gonorrhoeae infektioner relativt ovanliga i Sverige, även om en ökning skett de senaste tio åren, och flertalet svenska laboratorier utför endast enstaka resistensbestämningar per månad, vilket bidrar till kvalitetsförluster och/eller kostnadsökningar.

RAF rekommenderar således att endast laboratorier med särskilt intresse för N. gonorrhoeae utför resistensbestämning. Laboratorier med få isolat skickar isolaten till Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Universitetssjukhuset Örebro för artkonfirmering, typning, resistensbestämning och frysförvaring av samtliga isolat. En fullständig resistensbestämning motiveras bl a av att det nationellt och internationellt sker en snabb ökning av andelen stammar med nedsatt känslighet eller resistens mot i stort sett alla antibiotika aktuella för behandling. Svar på resistensbestämning lämnas till det insändande laboratoriet inom 2-3 arbetsdagar. Svar lämnas dock inte lördagar eller helgdagar men diagnostiken fortskrider under helgdagarna.

Förutom de kvalitativa, kvantitativa och ekonomiska fördelarna med att centralisera resistensbestämning av N. gonorrhoeae till ett laboratorium erbjuder detta även epidemiologiska vinster – samlad resistensövervakning, samlad stamkarakterisering, gemensam stambank, förbättrat underlag för expertfunktion och undervisning mm.

Introduction

Susceptibility testing of Neisseria gonorrhoeae poses special problems in the choice of media, methods, standardization, interpretations of results, and quality control/assurance.

The Swedish Reference Group for Antibiotics (SRGA) recommends that only laboratories with a special interest in N. gonorrhoeae perform complete antimicrobial susceptibility testing (AST. Laboratories with few isolates should send the isolates to the National Reference Laboratory for Pathogenic Neisseria, Örebro University Hospital for species confirmation, typing, AST, and preservation of all isolates.

Rekommendationer för resistensbestämning (enligt RAF och Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria)

Material och metoder

Referenssubstrat (GC Medium Base agar med 1 % hemoglobin och 1 % IsoVitaleX):

Deklaration (1 L):

1. GC Medium Base (BD) agar - 36 g

2. RO-vatten - 600 mL

3. Hemoglobin Powder - 10 g

4. RO-vatten - 400 mL

5. IsoVitaleX Enrichment - 10 mL

Beredning: Blanda C och D i en kolv. Rör om med omrörare 30 min. Blanda A och B i en kolv.
Autoklavera kolvarna: TEMP 121°C och tid 15 min
Beredning av tillsatser: Gör iordning E enl anvisningar på förpackningen. När agarn ska gjutas (låt svalna till ca 50°C i vattenbad), häll C-D (använd tratt och sil som finns sterilförpackade) i A-B samt blanda i E.
pH-värde: 7,0 - 7,4
Dispensering: 60 mL i 14 cm petriskål eller 25 mL i 9 cm petriskål så att ett 4 mm djupt agarskikt erhålles.
Förvaring: i sluten plastpåse, hållbarhet upp till 8 veckor.

Agarspädning referensmetod. Agarspädning är referensmetod för MIC-bestämningen men mindre väl lämpad som rutinmetod för gonokocker. Framförallt kan istället en kalibrerad och kvalitetssäkrad Etest användas som rutinmetod.

Etest som rutinmetod. Med Etest anges mätvärdet i mg/L och SIR-klassifikationen utförs med angivna brytpunkter i MIC-gränser från RAF, Tabell 1 och 2. Mätosäkerheten med Etest är ±1 MIC-steg (dvs. ±2 skal-streck på Etest-remsan).

Tolkning

Definition av känslighetsgrupperna S, I och R. Traditionell behandling av okomplicerad genital gonorré sker som en- (numera så gott som uteslutande praxis) eller tvådosbehandling med krav på utläkning i >95 % av behandlade fall där isolatet bedöms som känsligt för medlet ifråga. På grund av den snabbt ökande och utbredda antibiotikaresistensen, bristen på aktuella kliniska studier och att empirisk behandling ofta initieras innan resultat från resistensundersökning erhållits så används numera ofta en modifierad riktlinje, dvs. när resistensen mot ett individuellt antibiotikum är ³5 % så ska antibiotikumet exkluderas från rekommenderade förstahandspreparaten för behandling (i möjligaste mån bör även farmakodynamiska och farmakokinetiska parametrar vägas in i bedömningen).

MIC-gränser från RAF (Tabell 1 och 2) visar gränsvärden för indelning i känslighetsgrupperna S, I och R för N. gonorrhoeae vid okomplicerad gonorré. De aktuella gränsvärdena är fastlagda som artrelaterade gränser baserat på MIC-distributioner och, i möjlig mån, farmakodynamiska och farmakokinetiska parametrar vilket innebär att isolat som besvaras S kan förutsättas helt sakna resistensmekanismer mot medlet ifråga.

Intern kvalitetssäkring av resistensbestämning

Om ett relativt lågt antal gonokockisolat analyseras årligen på laboratoriet bör en intern kvalitetssäkring av resistensbestämningen ske i samband med varje klinisk resistensbestämning av N. gonorrhoeae. I annat fall kan en intern kvalitetssäkring utföras regelbundet (en gång per vecka eller månad beroende av antalet analyser) och vid ”batch”-byte av basagar. Lämpliga referensstammar beskrivs i tabellen nedan.

Referensstammar för kvalitetskontroll av resistensbestämning
Nationella referenslaboratoriet i Örebro rekommenderar följande gonokockstammar:

SSI 130/92 (CCUG 41810) (tetracyklin-resistent)
SSI 91-25 (CCUG 41811) (spectinomycin-resistent)
SSI 91-51 (CCUG 41812) (resistent mot benzylpenicillin, ampicillin och cefuroxim; beta-laktamas negativ)
SSI 40-1996 (CCUG 41813) (ciprofloxacin-resistent; beta-laktamas positiv).

Accepterade MIC-värden för referensstammarna då de analyseras med rekommenderad Etest metod framgår av tabellen nedan.

Referensstammarna kan erhållas från Culture Collection of the University of Gothenburg (CCUG).

Recommendations for antimicrobial susceptibility testing (according to SRGA and Swedish Reference Laboratory for Pathogenic Neisseria)

Materials and methods

Reference substrate (GC Medium Base agar with 1% hemoglobin and 1% IsoVitalex).

Declaration (1 L):

1. GC Medium Base (BD) agar - 36 g

2. Sterile water (RO-quality) - 600 mL

3. Hemoglobin Powder - 10 g

4. Sterile water (RO-quality) - 400 mL

5. IsoVitaleX Enrichment - 10 mL

Preparation: Mix C and D and stir for 30 minutes. Mix A and B in a separate flask.
Autoclave both mixtures (temperature 121°C for 15 min).
Prepare E (IsoVitaleX) in accordance with the package insert.
Mix C-D in A-B and add E.
pH: 7.0 - 7.4
Dispense: 60 mL in 14 cm petri dishes or 25 mL in 9 cm petri dishes to produce a 4 mm deep agar layer.
Store: in a sealed plastic bag for a maximum 8 weeks.

Agar dilution method. The agar dilution method is the reference method for determining MIC-values but less suited for routine AST. Instead, especially a calibrated Etest can be effectively used.

Etest for routine AST. The Etest gives values in mg/L and the results are classified as S, I or R with the MIC-breakpoints given in the MIC-breakpoint table 1 and 2 from SRGA. The reproducibility is ±1 dilution step (i.e. ±2 MIC-values according to the Etest strip).

Interpretation

S, I and R in uncomplicated genital gonorrhoea. Traditional therapy of uncomplicated genital gonorrhoea consists of one or two doses (nowadays is mainly one dose treatment used) of antibiotics with the expectance of a >95% cure if the isolate is considered susceptible to the antibiotic in question. However, due to the rapidly increasing levels of resistance globally, lack of appropriate clinical studies and widespread use of empirical treatment, presently a modified guideline is commonly utilised, i.e. when the level of resistance to an antibiotic reaches ³5%, the specific antibiotic should be excluded from the recommended first-line antibiotics. Ideally, pharmacodynamic and pharmacokinetic parameters also ought to be considered.  

MIC-breakpoints from SRGA (Table 1 and 2) show breakpoints for S-, I- and R-classification of N. gonorrhoeae in uncomplicated genital gonorrhoea. The breakpoints are based on species specific MIC-distributions and, if possible, pharmacodynamic and pharmacokinetic parameters. Strains classified as susceptible to these antibiotics can be considered devoid of resistance mechanisms.

Internal quality control of AST

If relatively few gonococcal isolates are annually analysed at the laboratory, an internal quality control of the AST should be performed whenever a routine AST is performed. If many isolates are analysed, an internal quality control can be performed once a week or once a month (dependent on the number of isolates) and when the batch of the base agar is changed. Suitable reference strains are described in the table below.

Reference strains for quality control of AST
The Swedish Reference Laboratory for Pathogenic Neisseria in Örebro recommends that the following gonococcal reference strains are used in the quality control of susceptibility testing. 

SSI 130/92 (CCUG 41810) (tetracycline resistant)
SSI 91-25 (CCUG 41811) (spectinomycin resistant)
SSI 91-51 (CCUG 41812) (resistant to benzylpenicillin, ampicillin and cefuroxime; beta-lactamase negative)
SSI 40-1996 (CCUG 41813) (ciprofloxacin resistant; beta-lactamase positive)

The accepted MIC-values, using the recommended Etest method, are shown in the Table below.

The reference strains can be obtained from the Culture Collection of the University of Gothenburg (CCUG).

Tabell. Accepterade MIC-värden (mg/L) vid resistensbestämning av referensstammar.
Table. Accepted MIC-values (mg/L) of reference strains.

Antimicrobial resistance in N. gonorrhoeae isolated in Sweden is shown in a separate table.