Stafylokocker

Staphylococci

1. Penicilliner
2. Methicillin resistens
3. Mecillinam
4. Cefalosporiner och karbapenemer
5. Aminoglykosider
6. Makrolider och klindamycin
7. Tetracykliner
8. Glykopeptider
9. Kinoloner
10. Mupirocin

1. Penicillins
2. Methicillin resistance
3. Mecillinam
4. Cefalosporins and carbapenems
5. Aminoglycosides
6. Macrolides and clindamycin
7. Tetracyclines
8. Glycopeptides
9. Quinolones
10. Mupirocin

Penicilliner.

Resistensbestämning av stafylokocker mot penicilliner och cefalosporiner förutsätter att meticillinresistens först uteslutits (undantag S.saprophyticus som sällan eller aldrig bär mecA-genen). Meticillinresistens (som beror på mecA-gensmedierad produktion av PBP2a) medför resistens mot alla betalaktammedel.

Med undantag för cefoxitin gäller de zonbrytpunkter som anges för betalaktamantibiotika enbart S.saprophyticus.

Eftersom >80 % av alla S.aureus och koagulasnegativa stafylokocker (und S.saprophyticus - ovanligt - och S.lugdunensis - ca 20%) bildar betalaktamas anser RAF att stafylokocker bör besvaras R mot penicillin G och V, ampicillin och piperacillin eller att man avstår från att ge SIR-beteckning för nämnda medel men bifogar kommentaren: "Stafylokocker är vanligen betalaktamasbildande".

S.saprophyticus: Obs! svagt positiv nitrocephintest hos S.saprophyticus skall ej tolkas som att stammen är betalaktamasbildande. Påvisande av meticillinresistens hos koagulasnegativa stafylokocker avser ej S.saprophyticus.

S.lugdunensis. Av 96 undersökta S.lugdunensis (nitrocephin och klöverbladstest) bildade 20 betalaktamas (2003), <1% var mecA-positiva, och <10% var resistenta mot klindamycin eller fusidinsyra. Cefoxitin 10 µg lapp kan med fördel användas för påvisande av meticillinresistens hos S.lugdunensis: brytpunkter 22/21 mm.

Penicillins.

Susceptibility testing of staphylococci to penicillins and cefalosporins should never be performed until methicillin-resistance has been ruled out (exception S.saprophyticus). Methicillin resistance (mediated by the mecA-gene and the production of PBP2a) confers resistance to all other betalactam drugs.

With the exception of cefoxitin the zone diameter breakpoints are only valid for S.saprophyticus.

Since >80% of S.aureus and Coagulase negative staphylococci (exceptions: S.saprophyticus and S.lugdunensis) produce betalactamase the SRGA recommends that Staphylococci can be designated R for penicillin G and V, ampicillin and piperacillin without betalactamase inhibitors.

S.saprophyticus: weakly positive nitrocephine test in S.saprophyticus: do not interpret this as indicative of betalactamase production.

S.lugdunensis. Of 96 investigated S.lugdunensis (nitrocephin and clover leaf test) 20 formed betalactamase (2003), <1% were positive for mecA and <10% were resistant to clindamycin or fusidic acid. The cefoxitin 10 µg disk can be used to disclose methicillin resistance in S.lugdunensis - breakpoints: 22/21 mm.

Isoxazolylpenicillin (MRSA och MRSE). Isoxazolylpenicilliner (meti-, oxa-, kloxa-, dikloxa- och flukloxacillin), cefalosporiner och karbapenemer är stabila mot stafylokockers betalaktamas. Stafylokocker som är känsliga för isoxazolylpenicillin (sk meticillinkänslig) kan betecknas S för samtliga isoxazolylpenicilliner, cefalosporiner och karbapenemer med följande undantag och rekommenderade SIR-beteckningar: ceftazidim (I), cefpodoxim (I) och ceftibuten (R).

Resistens mot isoxazolylpenicilliner (sk  meticillin-resistens) orsakas av produktionen av ett alternativt penicillinbindande protein, benämnt PBP2a.. Detta är en produkt av mecA- genen. PBP2a har låg affinitet för samtliga betalaktamantibiotika, inklusive nyare cefalosporiner och karbapenemer. När meticillinresistens påvisats skall man ej utföra resistensbestämning mot andra betalaktamantibiotika utan bakterien rapporteras resistent (R) mot samtliga betalaktamantibiotika.

Eftersom meticillinresistens hos S. aureus (MRSA) är ovanlig och får långtgående sjukhushygieniska konsekvenser bör man försäkra sig om korrekt artidentifikation samt konfirmera meticillinresistensen. Enstaka S.aureus uppvisar förhöjd MIC-värden för oxacillin, meticillin och/eller cefoxitin trots avsaknad av mecA-gen. De högre MIC-värdena kan bero på hyperproduktion av betalaktamas eller på andra resistensmekanismer änden  förändring i PBP2a som mecA-genen kodar för. Stammar med nedsatt känslighet för cefoxitin bör besvaras resistenta för penicilliner och cefalosporiner samtidigt som man klargör att det inte rör sig om MRSA. Stammen bör sparas och  närmare karakterisering utföras (MIC-bestämning, PFGE).

Screenmetoden med cefoxitin-lapp avslöjar nästintill all meticillinresistens hos S.aureus. Däremot utgör koagulasnegativa stafylokocker även fortsättningsvis ett problem i samma dignitet som med oxacillin-lappen. Med en viss säkerhetsmarginal i brytpunkten (S>27 R<26 mm), vilken medför en viss överrapportering av meticillin-resistens hos KNS, eller bruket av ett intervall (S>27 R<21 mm) inom vilket den slutliga tolkningen inväntar en PCR-analys för mecA-gen eller en agglutinationstest för PBP2a, kan cefoxitinlappen användas även på KNS (R.Skov et al, JAC 2005). 

Isoxazolylpenicillins (MRSA and MRSE).
Isoxazolylpenicillins (methicillin, cloxacillin, dicloxacillin and flucloxacillin), cefalosporins and carbapenems are stable against the betalactamases of staphylococci. If the staphylococcus is susceptible to isoxazolylpenicillin (lacks the mecA-gene) the SRGA recommends that all isoxazolylpenicillins, cefalosporins and carbapenems with staphylococcal activity (which today excludes ceftazidim (I), cefpodoxime (I) and ceftibuten (R)) can be designated S without further testing.

Resistance to isoxazolylpenicillins (i.e methicillinresistance) is caused by the bacterial production of an alternative penicillinbinding protein called PBP2a (syn. PBP2´). It is a product of the mecA-gene. PBP2a has low affinity for all betalactams, including new cefalosporins and carbapenems rendering their clinical activity insufficient. When methicillinresistance (MRSA or MRSE) has been shown to be present the bacterium should be classified resistant against all betalactam drugs.

Methicillinresistance in low-prevalence areas should be confirmed with a mecA-gene detection methodology,

Certain S.aureus high-level producers of betalactamase  exhibit false methicillin resistance ("borderline resistance, also called BORSA).

The SRGA-M recommends disc diffusion with cefoxitin for the detection of MRSA. Detection of methicillin resistance in coagulasenegative staphylococci is not significantly improved with the cefoxitin disc. However, with the use of an interval (S>27 R<21 mm) within interpretation awaits detection of the mecA-gene with PCR or PBP2a with agglutination, or the acceptance of a fraction of false resistance (S>27 R<26 mm) the cefoxitin disc can be used in CNS (R.Skov et al., JAC 2005)

The SRGA-M advices against the use of other betalactam discs in the susceptibilit testing of S.aureus and Coagulase negative staphylococci (with the exception of S.saprophyticus).

References:

1. McDougal L, Thornsberry C. The role of beta-lactamase in staphylococcal resistance to penicillinase- resistant penicillins and cephalosporins. J Clin Microbiol 1986; 23: 832.
2. Olsson-Liljequist B, Larsson P, Ringertz S, Löfdahl S. Use of a DNA hybridization method to verify results of screening for methicillin resistance in staphylococci. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1993; 12:527-533.
3. Brakstad OG, Maeland JA, Tveten Y. Multiplex polymerase chain reaction for detection of genes for Staphylococcus aureus thermonuclease and methicillin resistance and correlation with oxacillin resistance. APMIS 1993; 101:681-688.
4. Skov RL, Palleson LV, Poulsen RL, Espersen F. Evaluation of a new 3-h hybridization method for detecting the mecA-gene in Staphylococcus aureus and comparison with existing genotypic and phenotypic susceptibility testing methods. J Antimicrob Chemotherapy 1999; 43: 467-475.
5. Cavassini M, Wenger A, Jaton K, Blanc DS, Bille J. Evaluation of MRSA-Screen, a simple anti-PBP 2a slide agglutination kit, for rapid detection of methicillin resistence in Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1999; 37: 1591-1594.
6. Smyth RW, Kahlmeter G, Olsson Liljequist B and Hoffman BM. Methods for identifying methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Hospital Infection 48:103-107, 2001.
7. Skov R, Frimodt-Möller, N, Smyth R, Olsson-Liljequist B, Kahlmeter G. Evaluation of a cefoxitin 30 µg disc on Iso-Sensitest agar for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, July 1, 2003.
8. Skov, R, Smyth, R, Larsen, A R, Frimodt-Möller N, Kahlmeter G. Evaluation of cefoxitin 5 and 10 µg discs for the detection of methicillin resistance in Staphylococci. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 55, 157-161, 2005.

Lappdiffusionsmetod för detektion av meticillinresistens hos stafylokocker. 

• Medium A: ISA (Oxoid) utan tillsatser
• Antibiotika: Cefoxitin 10 µg lapp (Oxoid)

Metod

• Medium A: Grundmedium bereds enligt instruktioner från tillverkaren.
• Inokulat: Standardinokulat 
• Inkubering: Aerobt 16 - 20 h vid 35^oC (ej 36 eller 37 C).
• Avläsning: Zondiameter avläses vid zonens inre kant - obs! känsliga stammar (mecA-negativa) uppvisar oftast en dubbel  zonkant (en - två millimeter).
• Tolkning: Se MIC- och zonbrytpunktstabeller.
  Se zondistribution för S.aureus och Koagulasnegativa stafylokocker (Smyth et al, ICAAC 2003).

Disc diffusion method for the detection of methicillin resistance in staphylococci

• Basic medium: ISA (Oxoid) without additives
• Antibiotic: Cefoxitin 10 µg lapp (Oxoid)

Method

• Medium: The medium is prepared according to the instructions of the producer.
• Inoculum: Standard "next-to-confluent" inoculum.
• Incubation: Aerobically for 16 - 20 h at 35^o C (not 36 or 37 C).
• Reading: Read the inner edge of the zone diameter with a pair of calipers. Sensitive strains, i.e. strains negative for the mecA gene most often display a double zone edge (1-2 mm wide). See zone diameter distribution.
• Where is the salt, the dense inoculum or the lower temperature? Repeated testing of this methodology has not demonstrated an advantage of adding salt to the medium, increasing the density of the inoculum or lowering the temperature. It is important not to let the temperature exceed 36 C.

Tolkning

1. S.aureus som är cefoxitin känslig (se tabeller) betecknas meticillinkänslig S.aureus (MSSA) och kan utan ytterligare analys besvaras som känslig (S) för kloxacillin, dikloxacillin, flukloxacillin, imipenem, meropenem och för cefalosporiner med undantag för (i parentes anges normalpopulationens SIR-beteckning): ceftazidim (I), cefpodoxim (I) och ceftibuten (R).

2. S.aureus som är cefoxitin resistent (se tabeller) är med största sannolikhet meticillinresistent S.aureus (MRSA) och besvaras utan ytterligare tester resistent mot samtliga betalaktamantibiotika. Fyndet konfirmeras genom att mecA-gen och nuc-gen påvisas eller att PBP2a påvisas med agglutinationstest med monoklonala antikroppar (flera kommersiellt tillgängliga på marknaden).

Alla isolat skickas till SMI för epidemiologisk karakterisering. 

Fynd av MRSA är anmälningspliktiga.

S.aureus som efter omtestning bedöms cefoxitin-resistenta men är negativa i konfirmerande tester skickas till SMI för vidare undersökning.

Interpretation

1. S.aureus sensitive to cefoxitin (see Tables) is designated methicillin susceptible S.aureus (MSSA). It can without further testing be designated susceptible to cloxacillin, dicloxacillin, flucloxacillin, imipenem, meropenem and to cefalosporins with the following exceptions (in parenthesis the SIR-classification of the wild type): ceftazidim (I), cefpodoxim (I) och ceftibuten (R).

2. S.aureus resistant to cefoxitin are tested for the presence of the mecA-gene or its product PBP2a. Isolates with the mecA-gene are designated methicillinresistant S.aureus (MRSA) and the isolate can without further testing be classified as R against all betalactam drugs.

3. Koagulasnegativ stafylokock som är cefoxitin känslig (se tabeller) benämns meticillinkänslig (MSSE) och besvaras utan ytterligare tester känslig för (S) kloxacillin, dikloxacillin, flukloxacillin, imipenem, meropenem och cefalosporiner med god stafylokock-aktivitet. För S.lugdunensis är zonbrytpunkten 22/21 mm, dvs samma som för S.aureus.

4. Koagulasnegativ stafylokock som är cefoxitin intermediär eller resistent besvaras antingen som rmeticillinresistent koagulasnegativ stafylokock (MRSE) utan ytterligare undersökningar (varvid en viss procent falsk methicillinresistens accepteras) eller efterundersökes med PCR eller  PBP2a-agglutinationstest, och anges därefter som resistent mot eller, om negativ som känslig för, samtliga betalaktamantibiotika. För S.lugdunensis är zonbrytpunkten 22/21 mm, dvs samma som för S.aureus. 

3. Coagulase negative staphylococci (CNS) sensitive to  cefoxitin (see Tables) are classified as methicillin susceptible (MSSE). Without further testing they can be classified as susceptible to cloxacillin, dicloxacillin, flucloxacillin, imipenem, meropenem and to cefalosporins with good staphylococcal activity.

For S.lugdunensis the breakpoints are 22/21, i.e. the same as for S.aureus.

4. Coagulase negative staphylococci (CNS) resistant to cefoxitin are classified as methicillin resistant (MRSE) without further testing  and classified as resistant to all other betalactam drugs wwithout further testing.

Coagulase negative staphylococci labelled intermediately sensitive by the breakpoints are either classified as resistant (in which case a small per centage of falsely R-classified CNS is accepted) or re-tested with a confirmatory method (PCR för mecA-detection, PBP2a-detection-kit). SIR-classification of other betalactams is based on the methicillin classification.

For S.lugdunensis the breakpoints are 22/21, i.e. the same as for S.aureus.

S.aureus ATCC 29213 (MSSA)
S.aureus CCUG 35602 (BORSA, mecA-negativ)
S.aureus CCUG 35601 (MRSA, mecA-positiv)

Se även Kvalitetskontroll med referensstammar.

S.aureus ATCC 29213 (MSSA)
S.aureus CCUG 35602 (BORSA with excessive betalactamass production, mecA-negative)
S.aureus CCUG 35601 (MRSA, mecA-positive)

Mecillinam anses sakna aktivitet mot grampositiva bakterier, inklusive stafylokocker.
Kliniska studier talar för att S.saprophyticus  i urinvägarna utgör ett undantag (Burman et al, Läkartidningen 90:481-484, 1993). RAF avråder dock från resistensbestämning eftersom det saknas korrelation mellan MIC-värden och klinisk effekt.

Mecillinam lacks activity against Grampositive bacteria, including Staphylococci.
However, S.saprophyticus in the urinary tract may be a clinical exception, possibly due to the high concentrations achieved (L.G.Burman et al, Läkartidningen 90:481-484, 1993). Since there is no known correlation between S.saprophyticus MIC-values and clinical effect the SRGA does not recommend mecillinam susceptibility testing of the bacterium.

Cefalosporiner och karbapenemer.
Utför ej resistensbestämning av S.aureus och koagulasnegativa stafylokocker (und. S.saprophyticus) med lappar eller Etest för cefalosporiner (undantag cefoxitin) eller karbapenemer. Känslighet respektive resistens mot cefalosporiner och karbapenemer avgörs av avsaknad respektive förekomst av mecA-genen (se ovan, Isoxazolylpenicilliner).

Övriga zonbrytpunkter för betalaktamantibiotika i zonbrytpunktstabeller gäller enbart S.saprophyticus.

Cephalosporins and carbapenems. The susceptibility and resistance of staphylococci to cefalosporins and carbapenems is decided by the absence and presence of the mecA-gene (see above, Isoxazolylpenicillins).

Do not use cefalosporins or carbapenem discs for susceptibility testing of Staphylococci (with the exception of cefadroxil or cefalexin with S.saprophyticus). 

Other zone breakpoints for betalactam drugs refer only to S.saprophyticus.

Aminoglykosider (gentamicin, tobramycin, netilmicin och amikacin). Observera att S.aureus och koagulasnegativa stafylokocker har olika zonbrytpunkter i tabellerna. 

Aminoglykosides (gentamicin, tobramycin, netilmicin and amikacin). Observe that S.aureus and Coagulase negative staphylococci have different breakpoints in the SRGA tables.

Makrolider (erytromycin, roxitromycin, claritromycin,  azitromycin, telitromycin) och klindamycin. Om ej annat särskilt anges föreligger total korsresistens mellan makroliderna. Använd därför alltid  erytromycin 15 µg  som testlapp.

Viss typ av makrolidresistens drabbar även klindamycin. Inducerbar klindamycinresistens kan endast avslöjas i närvaro av en makrolid, dvs den kan inte konfirmeras med klindamycin MIC-bestämning. För att avslöja inducerbar klindamycinresistens, placera erytromycin- och klindamycin-lapparna bredvid varandra (ca 25 mm mellan disk-kanterna) i lapp-dispensern. Stammar som har inducerbar klindamycinresistens har en tilltryckt zon mot erytromycinlappen (se bilden). Sådana stammar besvaras R för samtliga makrolider och klindamycin och med kommentaren "Stammen har inducerbar klindamycinresistens".

Macrolides (erythromycin, roxithromycin, clarithromycin, azithromycin, telithromycin) and clindamycin. Unless otherwise stated there is total cross resistance between the macrolides. SRGA recommends the use of an erythromycin 15 µg disk for the detection of all macrolide resistance.

Certain macrolide resistance affects also clindamycin. For this reason eryhromycin and clindamycin discs should always be used simultaneously. Inducible clindamycin resistance is best disclosed by placing the erythromycin and clindamycin discs next to each other (allow a distance of at least 25 mm between the discs). Isolates with inducible clindamycin resistance exhibit a D-phenomenon as shown in the illustration, i.e. a flattening of the clindamycin inhibition zone towards the erythromycin zone. 

Tetracyklin. För stafylokocker gäller att tetracyklin 30 µg skall användas som testlapp oavsett vilket tetracyklinpreparat som anges i svaret.

Tetracycline. There is total cross resistance between the tetracycline derivatives. We recommend the use of a tetracycline 30 µg disk irrespective of which tetracycline the clinician plans to use.

Glykopeptider (vankomycin och teicoplanin). Meticillinresistenta S.aureus med  marginellt minskad känslighet för vankomycin (VISA eller GISA) har beskrivits sedan 1990-talet. De är svåra att upptäcka med konventionella metoder. Nyligen (2002) rapporterades från USA en MRSA som akvirerat en vanA-gen från enterokocker och blivit helt resistent mot glykopeptider. Den senare har otvetydig klinisk relevans och upptäcks sannolikt med rekommenderade lappdiffusionsmetoder.

Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) på inneliggande patienter kan många gånger vara så multiresistenta att enda behandlingsalternativ blir glykopeptidantibiotika. Hos KNS, särskilt hos S.hemolyticus, förekommer isolerad resistens mot teikoplanin.
 

Glycopeptides (vancomycin and teicoplanin). S.aureus strains with decreased susceptibility (VISA or GISA and hetero-VISA or hetero-GISA) to vancomycin  have been described. These have marginally elevated MIC-values to glycopeptides and are often found after longterm treatment with vancomycin. They are difficult to detect with conventional methods. 

Recently (2002) an MRSA with high vancomycin MIC-values and an acquired enterococcal vanA-gene  was described from the USA.

Coagulase negative staphylococci are often so multiresistant that no alternative but vancomycin or teicoplanin exists. It may be prudent to include a glycopeptide antibiotic in the susceptibility test even if the result is retained at the laboratory for future use. Coagulase negative staphylococci may be glycopeptide resistant, this is especially true for teicoplanin and  S.haemolyticus.

Kinoloner (norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin och moxifloxacin). RAF förordar stor restriktivitet angående bruket av kinoloner för stafylokockinfektioner. Resistensbesked för kinoloner ges endast på särskild begäran.

Stafylokocker utan resistensmekanismer mot kinoloner (norfloxacin 10 µg lapp ≥20 mm)  klassificeras av RAF S för ofloxacin, levofloxacin, ciprofloxacin och moxifloxacin. Stafylokocker med zoner ≤19 mm skall antas ha en eller flera resistensmekanismer och skall antingen besvaras R för samtliga kinoloner eller MIC-bestämmas för den aktuella kinolonen varefter de besvaras med hjälp av MIC-gränserna i RAFs tabeller.
 

Quinolones (norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin and moxifloxacin). The SRGA recommendation is to designate Staphylococci which lack quinolone resistance mechanisms S to ofloxacin, ciprofloxacin,  levofloxacin and moxifloxacin. The SRGA recommends that susceptibility test results are only given when specifically requested.

Staphylococci without resistance mechanisms to quinolones (norfloxacin 10 µg lapp ≥20 mm) are categorised as S for ofloxacin, levofloxacin, ciprofloxacin and moxifloxacin. Isolates with zone diameters ≤19 mm can be assumed to harbour quinolone resistance mechanisms and can either be categorised as R without further testing or be categorised according to their MIC-value.

Mupirocin. Resistensutveckling mot mupirocin förekommer och användningen bör därför begränsas till eradikeringsförsök vid bärarskap av MRSA.

I samarbete med BSAC (British Society for Antimicrobial Chemotherapy working party on antimicrobial susceptibility testing) har resistensbestämningen av S.aureus mot mupirocin utvärderats under 2005.

Tillverkaren förbereder produktion av en 20µg lapp. Tills dess rekommenderar RAF-M att man använder 5 µg lapp med brytpunkterna 24/23 mm som visserligen inte säkert skiljer mellan låg- och höggradig mupirocinresistens (men mupirocinresistens är ännu så ovanlig i Sverige att detta är ett mindre problem).

Detection of mupirocin resistance with a 20 µg mupirocin disc (not yet available):

ISA medium; semi-confluent growth, 20 µg mupirocin disc; incubation 35-37⁰C for 18-20 h; No zone MupA positive, 7-26 mm = low-level resistance, ³ 27 mm = S.

Strains with MIC-values of >256 mg/L: no zone.
Strains with MIC-values of 8 - 256 mg/L: zones 10 - 24 mm
Strains with MIC-values of <4 mg/L: zones >27 mm

Mupirocin. Resistance development against mupirocin occurs. The use of mupirocin should therefore be restricted to the use in carriers of MRSA.

In close cooperation with the British Society for Antimicrobial Chemotherapy working party on antimicrobial susceptibility testing (BSAC wp AST) new recommendations for mupirocin testing of S.aureus have been prepared. It is based on a mupirocin 20 µg disc (not yet available, April 2005).

Until then, SRGA recommends the use of a 5 µg disc and the breakpoints 24/23 mm. This will reliably separate resistant from sensitive S.aureus but will not discriminate between low- and high level resistance.

Detection of mupirocin resistance with a 20 µg mupirocin disc (not yet available):

ISA medium; semi-confluent growth, 20 µg mupirocin disc; incubation 35-37⁰C for 18-20 h; No zone MupA positive, 7-26 mm = low-level resistance, ³ 27 mm = S.

Strains with MIC-values of >256 mg/L: no zone.
Strains with MIC-values of 8 - 256 mg/L: zones 10 - 24 mm
Strains with MIC-values of <4 mg/L: zones >27 mm
 

Mupirocin graph will be included