Enterokocker

Enterococci

1. Identifiering av E.faecalis och E.faecium
2. Penicilliner
3. Cefalosporiner
4. Karbapenemer
5. Aminoglykosider
6. Glykopeptider

1. To identify E.faecalis and E.faecium
2. Penicillins
3. Cefalosporines
4. Carbapenems
5. Aminoglycosides
6. Glycopeptides

Diagnostik av enterokocker. Det finns flera anledningar att skilja i första hand Enterococcus faecalis från Enterococcus faecium och i andra hand dessa från andra Enterokock-arter. E.faecalis är i motsats till E.faecium nästan alltid ampicillinkänslig. Den ökande användningen av screeningmetoder för att fånga glykopeptidresistenta enterokocker i faecesprover och/eller perianalprover genom att dessa strykes på medier innehållande selekterande och differentierande substanser, inklusive koncentrationer av vankomycin, har medfört att man ibland använder mycket tid och resurser på att först verifiera att den bakterie som fångats i screenen verkligen är en enterokock. Det är vanligt att även andra bakterier (lactobacillus, lactococcus, pediococcus m fl) med inherent resistens mot vankomycin och/eller teikoplanin fastnar i screenodlingen. Med gramfärgning och  PYR-test innan ytterligare åtgärder vidtages spar man sig mycket arbete. Enterokocker är alltid PYR-positiva (enterokocker hydrolyserar l-pyrrolidonyl-betanaphtylamid till betanaphtylamin och ger ett rött omslag tillsammans med aminopeptidasreagens).

E.faecalis kan skiljas från övriga enterokocker med en arabinosplatta. E.faecalis är arabinos negativ (99 %) medan E.faecium, E.gallinarum och E.casseliflavus är positiva (gula kolonier på arabinosplatta). De sistnämnda två isoleras dock sällan från kliniska prover men utgör ett problem i sb med screening av faeces- eller perianalprover på förekomst av glykopeptidresistenta enterokocker. Tabellen nedan ger förslag på hur de olika enterokockerna på ett enkelt sätt kan skiljas från varandra. Rörligheten kan bestämmas med mikroskopi eller med vissa TTC-rör.

To identify enterococci. The increased use of screening procedures to catch enterococci resistant to vancomycin and/or teikoplanin entails the systematic culture of fecal and/or perineal samples on a variety of media containing a selective concentration of vancomycin. Enterococci are not the only grampositive bacteria resistant to vancomycin so the screening schemes often land a motley catch of inherently resistant enterococci, lactobacilli, lactococci and others plus at times E.faecalis and/or E.faecium with vanA- or vanB-genes. The first prerogative of the screening procedure is to separate Enterococci with aquired glycopeptide resistance from the other bacteria. Always perform a gramstain and a PYR-test. Enterococci are always PYR-positive. They give a red reaction together with aminopeptidase after hydrolysis of l-pyrrolidonyl-betanaphtylamid to betanaphtylamin.

E.faecalis and E.faecium can be separated by culturing them on an arabinoseplate (yellow colonies signify a positive reaction). E.faecalis is arabinose negative (99 %) while E.faecium is arabinose positive (95-97 %) as are E.gallinarum and E.casseliflavus. The latter two are only rarely found in clinical samples but will constitute a problem when screening fecal or perineal samples for glycopeptide resistant enterococci. The table below suggests simple ways of diagnosing enterococci.

Penicilliner. Inhemska isolat av E.faecalis har hittills alltid varit  känsliga för penicilliner. Från USA har rapporterats E.faecalis som producerar betalaktamas. Detta avslöjas "endast" med nitrocefintest (ej med ampicillin 10 µg lapp eller Etest).

E.faecium från kliniska prov är oftast resistenta mot ampicillin (i ett blandat material från samhälle och sjukhus med 671 E.faecium var >75 %  resistenta mot ampicillin).

Penicilliner. Swedish isolates of E.faecalis are almost always sensitive to penicillin. Internationally there are rare isolates that produce betalactamase. Should laboratories want to screen for betalactamase production they are adviced to use the nitrocephin test - disk diffusion or Etest will not disclose the betalactamase.

E.faecium from clinical samples are most often resistant to ampicillin (in a mixed community and hospital material of 671 E.faecium >75 % were resistant to ampicillin).

Cefalosporiner.  Alla enterokocker betraktas som resistenta mot cefalosporiner.

Cefalosporins. All enterococci should be considered resistant to cefalosporins.

Aminoglykosider (gentamicin, tobramycin, netilmicin och amikacin). Enterokocker betraktas som naturligt (låggradigt) resistenta mot aminoglykosider. De kan inte ensamt användas för behandling av enterokock-infektioner, men uppvisar i kombination med cellväggsantibiotika (penicilliner/glykopeptider) synergistisk effekt mot enterokocker. Kombinationen cellväggsantibiotika och aminoglykosid har varit mycket framgångsrik vid behandling av svåra enterokockinfektioner (endokardit). Vid höggradig aminoglykosidresistens (HLAR, se nedan) uteblir den synergistiska effekten mellan aminoglykosid och betalaktam. Behandlande läkare bör varnas för detta med en kommentar i sb m allvarliga infektioner, särskilt endokardit.

RAFs förslag till kommentar vid höggradig aminoglykosidresistens:
"Enterococcus spp med höggradig gentamicinresistens (gentamicin MIC>128 mg/L) varför den synergistiska effekt som vanligen ses mellan bensylpenicillin (alt ampicillin) och gentamicin ej föreligger. Sannolikt drabbas även övriga aminoglykosider."

 Höggradig aminoglykosidresistens (HLAR) orsakas oftast av aac(6´)le-aph(2´´)la genen som kodar för det vanligast förekommande HLAR-enzymet hos enterokocker. Resistensbestämning skall utföras med gentamicin varvid avsaknad av zon runt en 30 µg lapp signalerar HLAR vilket bekräftas med MIC-bestämning varvid ett gentamicin MIC-värde >128 mg/L innebär att kriterierna för HLAR uppfylls varvid stammen besvaras höggradigt resistent mot gentamicin, netilmicin, tobramycin och amikacin utan ytterligare tester. Om man inte anser sig vilja/kunna göra MIC-bestämning är sensitiviteten god nog med lapptest under det att specificiteten är något sämre (dvs falsk HLAR kan förekomma).
Om behandlande läkare önskar använda en annan aminoglykosid än gentamicin och isolatet uppträder som låggradigt resistent mot gentamicin, utesluter detta inte höggradig resistens mot netilmicin, tobramycin eller amikacin. Dessa måste då undersökas var för sig. Detta gäller särskilt E. faecium, där majoriten av kliniska isolat har ett kromosomalt kodat, icke överförbart, HLAR-enzym, vilket förmedlar höggradig resistens mot tobramycin och netilmicin, men inte mot gentamicin och amikacin.

Aminoglycosides (gentamicin, tobramycin, netilmicin och amikacin). Despite the inherent insensitivity of enterococci to aminoglycosides, synergy between aminoglycosides and penicillins (bensylpenicillin or ampicillin) is common. The strategy of combining aminoglycoside and penicillin in the treatment of endocarditis caused by enterococci has been very successful over the years. This strategy is threatened by the development of  high-level aminoglycoside resistance (HLAR) in enterococci (gentamicin MIC:s of >128 mg/L; no zone around a gentamicin 30 µg disc). These strains most often carry the aac(6´)Ie-aph(2´´)Ia gene encoding for the most common HLAR-enzyme in enterococci. In these strains no synergy between aminoglycosides and betalactams is obtained. If the gentamicin MIC is >128 mg/L (or if an MIC-test against gentamicin is not performed and there is no zone around the gentamicin 30 µg disc) the strain should be considered High-Level-Resistant to all aminoglycosides. However, strains without the gentamicin criteria for HLAR cannot automatically be considered devoid of acquired resistance mechanisms to the other aminoglycosides; this is especially true for E.faecium.

The clinician should be warned about HLAR and its consequences. SRGA suggests that the HLAR-information is accompanied by the following comment:
"In Enterococcus spp with high-level aminoglycoside resistance (gentamicin MIC>128 mg/L) the synergistic effect between the aminoglycoside and the penicillin (or ampicillin) is lost. Most often this will also be true for other aminoglycosides."

.

Glykopeptider (vankomycin, teikoplanin). 
Enterokocker med resistens mot vankomycin, med eller utan samtidig resistens mot teikoplanin, rapporteras allt oftare vara ett problem på sjukhus runt om i världen. Även i Sverige har både E.faecalis och E.faecium med vankomycinresistens isolerats. Resistensen betingas av att bakterien producerar ett protein (ett alternativt ligas), vars produkt är en byggsten i cellväggen (D-ala-D-ser) som avviker från den normala byggstenens utseende (D-ala-D-ala). De avvikande byggstenarna har en förändring i konfigurationen så att bindningen till glykopeptider är reducerad.
Resistens mot glykopeptider kan delas upp i naturlig (intrinsic resistance) och förvärvad resistens.
Naturlig resistens förekommer hos E.gallinarum, E.casseliflavus och E.flavescens och den är associerad med vanC1, vanC2 respektive vanC3 genen. MIC för dessa stammar är 4 - 8 mg/L för vankomycin och <2 mg/L  för teikoplanin.
Förvärvad resistens uttrycks via vanA och vanB generna. Båda har påvisats hos E.faecalis och E.faecium och en eller båda dessutom hos flera andra enterokock-arter såsom E.durans, E.casseliflavus och E.gallinarum. vanA-genen orsakar höggradig resistens mot både vankomycin (MIC > 64 mg/l) och teikoplanin (MIC 8 - > 128 mg/l). vanB-genen förknippas vanligen med mindre uttalad vankomycinresistens (MIC 4 - 64 mg/L) och med samtidig känslighet för teikoplanin (MIC < 2 mg/L).

Glykopeptides (vancomycin, teicoplanin).  Enterococci with glycopeptide resistance is increasingly becoming a problem in hospital wards around the world. The resistance is caused by the genes vanA, vanB or vanC which code for an alternative ligase, the product of which is a building block (D-ala-D-ser) in the bacterial cell wall different from the normal product (D-ala-D-ala). The binding of glycopeptides to the alternate product is reduced.
Resistance to glycopeptides is either intrinsic (vanC-genes in E.gallinarum, E.casseliflavus, E.flavescens) or aquired (vanA- and vanB-genes in E.faecalis and E.faecium and several other Enterococcus spp.). The vanC-genes confer resistance in the magnitude of vancomycin MIC:s of 4-8 mg/L and teicoplanin MIC:s of <2 mg/L .
Acquired resistance. The vanA-gene causes high-level resistance to both vancomycin and teicoplanin (MIC of vancomycin >64 mg/L, MIC for teicoplanin of 8 - >128 mg/L).
The vanB-gene causes resistance to vancomycin (MIC of vancomycin 4 - 64 mg/L) whereas the activity of teicoplanin is not affected (MIC of teicoplanin <2 mg/L).

Detektion av vankomycinresistens förutsätter att E.faecalis skiljs från E.faecium och båda från övriga enterokocker.

Vid avläsning av zonerna, var uppmärksam på zonkanten. Vankomycinkänsliga stammar uppvisar en skarp zonkant, resistenta stammar har ofta en diffus zonkant. Stammar med avvikande zon (se zonbrytpunkter) och/eller diffus zonkant bör MIC-bestämmas och undersökas med PCR för att utesluta respektive verifiera förekomsten av vanA/vanB-gener. Genotypisk verifiering av resistensen kan göras med PCR.

Teikoplanin bör normalt inte användas som testsubstans. Enterokocker med vanA besvaras vancomycin-R och teikoplanin-R och med kommentaren "Stammen uppvisar glycopeptidresistens (gen: vanA) som drabbar vancomycin och teicoplanin.". 
Enterococcer med vanB besvaras vancomycin-R och teicoplanin-S men med kommentaren Stammen uppvisar glykopeptidresistens (gen: vanB) som huvudsakligen drabbar vankomycin".

Referensstammar. E.faecium CCUG 36804: vanA med vankomycin-MIC >128 mg/l. E.faecium CCUG 33829: vanB med vankomycin-MIC 8-32 mg/l. Se även Kvalitetskontroll med referensstammar.

Detection of glycopeptide resistance. To detect glycopeptide resistance in enterococci a correct species identification is paramount.

When reading vancomycin (or teicoplanin) zone diameters observe the zone edge which is sharp in vancomycin susceptible strains and diffuse in vancomycin resistant strains. Strains with fuzzy zone edges and/or decreased zondiameters should be further analyzed with MIC-determination and PCR to confirm the presence of a vanA- or vanB-gene. Genotypic verification of the resistance determinant can be done with PCR-technique.

Avoid using teicoplanin for susceptibility testing.  Enterococci with vanA should be classified vancomycin-R and teicoplanin-R irrespective of MIC-values. The following comment can be added: "This isolate exhibits vanA-glycopeptideresistance which affects both vancomycin and teicoplanin".
Enterococci with vanB should be classified vancomycin-R and teicoplanin-S.  The following comment can be added:  "This isolate exhibits vanB-glycopeptideresistance which affects primarily vancomycin and not teicoplanin".

Reference strains. E.faecium CCUG 36804: vanA with vankomycin-MIC >128 mg/L and E.faecium CCUG 33829: vanB med vankomycin-MIC 8-32 mg/L (see also Quality Control with reference strains).

References

1. Kak, V., Chow, J.W. (2002). Acquired antibiotic resistance in Enterococci. In The enterococci - pathogenesis, molecular biology and antibiotic resistance. (Ed.; M. S. Gilmore.) Washington DC, ASM Press: 355-83.
2. Hanaki H, Yamaguchi Y, Nomura S, Nagayama A, Sunakawa K Int J Antimicrob Agents. 2004 May;23(5):502-5.:Rapid detection and differentiation method of VanA, VanB and VanC phenotypes in vancomycin-resistant enterococci.

RAF & RAF-M
Uppdaterat 2007-05-28, G Kahlmeter

SRGA & SRGA-M
Revised 2007-05-28, G Kahlmeter